Tính chất hoá lý của muối ankyl thuỷ ngân phụ thuộc vào bản chất của anion liên kết. Ví dụ, metyl thuỷ ngân cysteinat tan trong nước nhưng không tan trong benzen trong khi metyl thuỷ ngân clorua không tan trong nước mà lại tan trong dung môi hữu cơ. Sự khác nhau về tính chất hoá lý này đã được dùng để làm sạch mẫu trước khi phân tích.
Dimetyl thuỷ ngân được sinh ra trong quá trình metyl hoá metyl thuỷ ngân là một chất độc dễ bay hơi có độ tan thấp trong nước và bị phân huỷ từng phần khi chiết trong môi trường axit mạnh. Dimetyl thuỷ ngân có thể bị mất trong khi bảo quản mẫu, đồng nhất mẫu, chiết hoặc trong các quá trình khác của chuẩn bị mẫu. Mặc dù nó được phát hiện trong một số mẫu môi trường, hiện nay chưa có phương pháp thích hợp nào để định lượng đimetyl thuỷ ngân trong các mẫu môi trường.
Quá trình phân tích các dạng thuỷ ngân được thực hiện sau khi đã tách các dạng khác nhau của chúng và đo định lượng mỗi loại bằng các phương pháp nhạy và chọn lọc phù hợp. Những phương pháp dùng để tách các dạng thuỷ ngân bao gồm: sắc ký lỏng, sắc ký khí, chiết chọn lọc, điện phân, điện li, đông kết tủa, phản ứng hoá học và tạo hỗn hống [28, 29].
Hiện nay trên thế giới đã có hơn 100 quy trình để phân tích các dạng thuỷ ngân qua việc kết hợp giữa phương pháp đo và kỹ thuật tách như trên. Tuy nhiên chỉ có rất ít quy trình được sử dụng rộng rãi vì giá thành cao và hạn chế về độ lặp lại, độ chính xác và tốc độ phân tích mẫu. Những phát triển gần đây cho thấy, việc tách các dạng thuỷ ngân sử dụng HPLC, GC kết hợp với phương pháp đo phổ phát xạ plasma, phổ khối và phổ hấp thụ nguyên tử đã
nâng cao khả năng phát hiện và đo chọn lọc các dạng thuỷ ngân [30].
1.2.2.1. Phương pháp khử chọn lọc
Quá trình định dạng các hợp chất thuỷ ngân có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hoá hơi lạnh [31]. Phương pháp được Magos đề xuất năm 1979 dựa trên kỹ thuật khử chọn lọc các hợp chất thuỷ ngân vô cơ và hữu cơ. Metyl thuỷ ngân trong cystein bị khử rất chậm bằng thiếc II clorua trong môi trường kiềm còn muối thuỷ ngân vô cơ bị khử ngay lập tức thành dạng hơi nguyên tử. Khi thêm CdCl2 vào SnCl2 làm tăng tốc độ khử metyl thuỷ ngân. Do vậy, quá trình khử chọn lọc có thể kiểm soát được trong môi trường kiềm bằng cách sử dụng SnCl2 hoặc SnCl2 + CdCl2 [32, 33]. Thông qua việc thay đổi điều kiện khử trong hệ phản ứng tự động, năm 1980 tác giả Gouldel đã xác định được dạng thuỷ ngân vô cơ, thuỷ ngân có vòng thơm và ankyl thuỷ ngân bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử.
Việc xác định đồng thời metyl thuỷ ngân, thuỷ ngân vô cơ, và tổng thuỷ ngân trong trầm tích có thể thực hiện bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử kết hợp với sắc ký khí. Các dạng thuỷ ngân được etyl hoá ở nhiệt độ phòng bằng natri tetraetylborat [34], dạng metyl thuỷ ngân và thuỷ ngân II được chuyển hoá thành etyl thuỷ ngân và metyl-etyl thuỷ ngân dễ bay hơi được tách bằng sắc ký khí, sau đó các dạng này được chuyển hoá tới cuvet thạch anh nung ở nhiệt độ 8000C để hoá hơi, nguyên tử hoá và phát hiện bằng phổ hấp thụ nguyên tử.
Quá trình khử chọn lọc sử dụng NaBH4 và SnCl2 để phân tích dạng thuỷ ngân cũng được nhiều tác giả nghiên cứu [32]. Thuỷ ngân vô cơ được khử về dạng hơi nguyên tử và xác định bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hoá hơi lạnh, các dạng thuỷ ngân hữu cơ được khử
bằng NaBH4 về các dạng hyđrua sau đó tách bằng sắc ký khí và phát hiện bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử.
Các bước tối ưu hoá của quy trình tạo hyđrua cho việc phân tích thuỷ ngân sử dụng cuvet thạch anh có gia nhiệt để tăng độ nhạy trong phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã từng được một số bài thảo luận [22, 35]. Các kết quả chỉ ra rằng, khi tăng nhiệt ở cuvet thạch anh, khả năng hoá hơi nguyên tử của thuỷ ngân sẽ tăng lên và độ nhạy của phương pháp cũng được tăng lên, tuy nhiên khi nhiệt độ cao thì tuổi thọ của cuvet thạch anh cũng giảm, do vậy nhiệt tối đa cho quá trình này là 10000C.
Người ta cũng đã kết hợp phương pháp điện phân và phổ hấp thụ nguyên tử để phân tích dạng thuỷ ngân [36]. Thuỷ ngân vô cơ được kết tủa trên điện cực Pt với hiệu suất 95% tại -0,1V, trong khi thuỷ ngân hữu cơ bắt đầu kết tủa khi thế nhỏ hơn -0,2 V. Sau khi điện phân tại -0,1 V, thuỷ ngân hữu cơ được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật hoá hơi lạnh. Thuỷ ngân vô cơ được xác định qua dung dịch ban đầu bằng cách khử với SnCl2.
1.2.2.2. Phương pháp chiết
Thuỷ ngân tổng số được xác định nhanh bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật lò graphit [37], hoặc kỹ thuật hoá hơi lạnh. Các dẫn xuất của thuỷ ngân hữu cơ được chiết vào clorofom hoặc benzen hoặc toluen sau đó được giải chiết trong dung dịch natrithiosunfat và xác định như thuỷ ngân tổng số. Một số tác giả cũng đề xuất quy trình chiết bằng cách tạo phức với đithizon trong benzen để xác định metyl thuỷ ngân, còn hàm lượng thuỷ ngân tổng số được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử.
Năm 1966 Westoo đã xây dựng quy trình chiết ngược [38], trong đó metyl thuỷ ngân clorua được chiết vào benzen và sau đó giải chiết trong dung
dịch cystein tạo thành phức thuỷ ngân cysteinat tan trong nước. Sau khi axit hoá để phân huỷ phức thuỷ ngân với cystein, metyl thuỷ ngân lại được chiết vào benzen. Quy trình này đã được giới thiệu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới.
1.2.2.3. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản (CE) là kỹ thuật tách hiệu quả đối với nhiều loại chất, từ các ion kim loại đến các hợp chất sinh học có khối lượng phân tử lớn. Trong phương pháp điện di mao quản, quá trình tách dựa trên sự dịch chuyển khác nhau của các chất trong điện trường. Các cation kim loại dịch chuyển về phía catot, chúng được solvat hoá và mang theo dung dịch hướng về phía âm của mao quản tạo thành dòng điện di. Những ion có điện tích cao và kích thước nhỏ sẽ dịch chuyển nhanh hơn các ion có kích thước lớn hơn và điện tích nhỏ hơn, nghĩa là những chất có tỉ lệ giữa điện tích và kích thước càng lớn thì tốc độ di chuyển trong điện trường càng nhanh. Thông thường mao quản sử dụng trong phương pháp điện di mao quản là ống silica, có đường kính trong từ 20 - 100 µm và chiều dài từ 50 - 100 cm. Thế điện áp được đưa vào trong ống mao quản từ 20 - 30 kV.
Việc áp dụng phương pháp điện di mao quản kết hợp với phổ khối lượng với nguồn cảm ứng cao tần plasma (CE - ICP - MS) đã được nhiều tác giả nghiên cứu [26]. Các dạng thuỷ ngân thường được tạo phức để tạo thành các hợp chất mang điện trước khi tách bằng phương pháp điện di mao quản, các tác nhân tạo phức thường được sử dụng là systein, đithizon sunphonat. Phương pháp này thường có nhược điểm là thể tích mẫu được sử dụng rất nhỏ (khoảng 10nl) dẫn đến độ nhạy của phương pháp thấp hơn nhiều so với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Do vậy việc áp dụng để phân tích dạng thuỷ ngân trong các mẫu môi trường và sinh học vẫn còn hạn chế.
1.2.2.4. Phương pháp sắc ký khí
phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để xác định metyl thuỷ ngân trong các mẫu sinh học và môi trường [39, 40, 41].
Trong phương pháp sắc ký, các dạng thuỷ ngân được tách dựa trên sự khác nhau của nhiệt độ bay hơi và sự tương tác của chúng với pha tĩnh. Hiện nay, người ta thường sử dụng hai loại cột tách là cột nhồi và cột mao quản. Cột mao quản thường có chiều dài từ 10 đến 100 m và đường kính trong khoảng 0,2 đến 0,7 mm, thành trong của loại cột này được tẩm một lớp pha tĩnh mỏng, có chiều dày từ 0,2 đến 5 µm. Cột sắc ký đặt trong buồng điều nhiệt và được điều khiển bởi chương trình nhiệt độ. Pha động thường được sử dụng là khí trơ heli hoặc nitơ để vận chuyển các chất bay hơi đến detector. Nhiệt độ và tốc độ pha động có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tách các dạng thuỷ ngân [30].
Để đạt hiệu quả cao trong quá trình tách bằng sắc ký khí, các dạng thuỷ ngân phải được chuyển hoá thành các hợp chất bay hơi và bền nhiệt. Thuốc thử Grignard thường được sử dụng để butyl hoá các dạng thuỷ ngân [42], thuỷ ngân được chiết vào dung môi hữu cơ sau đó phản ứng với thuốc thử Grignard, hiệu suất chiết của các dạng thuỷ ngân trong các đối tượng mẫu khác nhau có ảnh hưởng lớn đến kết quả phân tích. Trong thời gian 5 phút, phản ứng giữa các dạng thuỷ ngân và thuốc thử Grignard xảy ra hoàn toàn, nếu cho dư thuốc thử, các dạng thuỷ ngân sẽ chuyển hoá thành đibutyl thuỷ ngân, dẫn đến không phân biệt được các dạng thuỷ ngân. Sự có mặt của các halogen trong mẫu như brom và iot sẽ phá huỷ các hợp chất ankyl thuỷ ngân trong quá trình phân tích.
Natri tetraetyl borat cũng được sử dụng để etyl hoá các dạng thuỷ ngân trong dung dịch [43]. Các dạng etyl thuỷ ngân được bay hơi và hấp phụ trong cột. Các dạng thuỷ ngân sau khi etyl hoá cũng được chiết vào dung môi hữu cơ như hexan hoặc iso-octan sau đó bơm vào cột sắc ký bằng phương pháp truyền thống.
sắc ký khí như metyl thuỷ ngân metylen bromua (MeHgCH2Br) và các dẫn xuất của điankyl sử dụng metyl cobalamin đã được nhiều tác giả đề cập [44]. Trong phương pháp này người ta sử dụng propyl thủy ngân bromua như là một chất nội chuẩn.
Người ta cũng đã sử dụng cột nhồi thay cho cột mao quản trong phương pháp GC-ECD để phân tích thuỷ ngân vô cơ và thuỷ ngân hữu cơ trong các mẫu sinh học. Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng cột nhồi pha tĩnh AT-1000 cho hiệu quả tốt nhất để tách các dạng metyl thuỷ ngân, etyl thuỷ ngân và phenyl thuỷ ngân [41].
1.2.2.5. Phương pháp sắc ký lỏng
Việc sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định dạng thuỷ ngân có ưu điểm là chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần phải tạo các hợp chất dễ bay hơi, bền nhiệt phức tạp như trong phân tích bằng sắc ký khí. Việc sử dụng kết hợp giữa HPLC cùng detector quan phổ hấp thụ nguyên tử là một phương pháp định dạng đơn giản và chọn lọc các kim loại [45].
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tách các dạng thuỷ ngân có độ phân cực khác nhau trên cột nhồi silicagen có đường kính hạt từ 3- 10µm. Trên bề mặt của hạt có phủ một lớp pha tĩnh thông thường là octadecylsilan (ODS), các loại cột sử dụng pha tĩnh này được gọi là cột C18. ODS là một chất không phân cực do vậy nó phải kết hợp với dung môi pha động phân cực [46]. Khi chất phân tích được bơm vào sẽ xuất hiện cân bằng giữa pha động và pha tĩnh, các chất phân cực có thời gian lưu ngắn hơn do cân bằng dịch chuyển theo hướng pha động, còn các chất không phân cực sẽ dữ lại trên pha tĩnh do vậy thời gian lưu dài hơn. Dựa trên nguyên tắc này mà các dạng thuỷ ngân được tách bằng kỹ thuật sắc ký, để tăng độ nhạy và khả năng tách của kỹ thuật phân tích, các dạng thuỷ ngân thường được phản ứng với các hợp chất có chứa lưu huỳnh như
mecaptoetanol, pyrrolidinedithiocarbamat và mercap - tobenzothiazole [47]. Do thuỷ ngân dễ hấp thụ trên bề mặt của thép gây ra hiệu ứng lưu trong quá trình phân tích do vậy cột sắc ký và vòng bơm mẫu cần phải sử dụng vật liệu là thuỷ tinh trong thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao.