CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.3. Tính đa dạng về di truyền
Trong 10 mẫu Ý dĩ được gửi đến phòng thí nghiệm Macrogen, Hàn Quốc để giải trình tự gen thì mẫu Y8 quá trình giải trình tự gen không thành công, nên ta chỉ xác định tính đa dạng di truyền của 9 mẫu còn lại gồm Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y9 và Y10 (Bảng 2.1).
- Sau khi tiến hành giải trình tự gen thu được trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ (Phụ lục 5) .
- Dựa vào trình tự nucleotid, xác định được độ tương đồng di truyền của 9 mẫu Ý dĩ (Phụ lục 6). Trong đoạn trình tự khảo sát là ITS1 – 5.8S – ITS2 thì trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ ít có sự khác biệt với độ tương đồng di truyền giữa các mẫu dao động từ 97% đến 99%.
- Trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ và trình tự nucleotid của 7 đoạn so sánh được gióng hàng trong phần mềm Bioedit, trong đó các nucleotid bôi màu vàng là các nucleotid khác biệt của các đoạn trình tự nghiên cứu (Phụ lục 7). Sử dụng phần mềm PAUP để xây dựng cây phân loại, kết quả 9 mẫu Ý dĩ được chia thành 4 nhóm (Hình 3.14) Nhóm 1 gồm mẫu Y1 (Mai Sơn – Sơn La). Nhóm 2 gồm các mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình) và Y3 (Đạo Trù – Vĩnh Phúc). Nhóm 3 gồm các mẫu Y4 (Hoàng Mai – Hà Nội), Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn) và Y10 (Yên Sơn – Ba Vì); trong đó mẫu Y10 được xếp thành 1 nhóm riêng và 2 mẫu Y4 và Y9 được xếp thành 1 nhóm riêng. Nhóm 4 gồm các mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan), Y6 (Thuận Châu – Sơn La) và Y7 (Mường Thanh – Điện Biên); trong đó mẫu Y6 được xếp thành 1 nhóm riêng và 2 mẫu Y5 và Y7 được xếp thành 1 nhóm riêng. Dựa cào cây phân loại ta thấy mẫu Y5 và Y7 có trình tự giống với các đoạn trình tự đã được công bố nhất.
BÀN LUẬN
Về đặc điểm hình thái và nông học
Các kết quả theo dõi chỉ tiêu nông – sinh học cho thấy các mẫu Ý dĩ đều phát triển tốt trong điều kiện tiến hành thực nghiệm. Trong cùng một điều kiện tiến hành thí nghiệm các mẫu Ý dĩ có tốc độ phát triển khác nhau, tại thời điểm báo cáo (tháng 05/2013) mới có 7 mẫu ra hoa là mẫu Y1, Y2, Y5, Y6, Y7, Y8 và Y9. Mặt khác, các mẫu này do được trồng không đúng thời vụ nên cây bị ép ra hoa khi mới trồng trong thời gian ngắn. Nói chung đề tài này mới chỉ dừng lại ở qui mô nhỏ (số lượng mẫu là 10), do đó cần mở rộng nghiên cứu thêm các mẫu ở miền Bắc Việt Nam. Tuy nhiên, đề tài này có đặc điểm nổi bật là các mẫu được trồng tại cùng một
địa điểm, cùng một mùa vụ nên hạn chế được sự tác động của một số yếu tố ngoại cảnh như Đất đai, địa hình, khí hậu, độ cao,…và có sự nghiên cứu lặp lại 4 mẫu đã được tiến hành năm 2012 (Bảng 2.1). Nhìn chung, về đặc điểm hình thái của các cơ quan sinh dưỡng (lá, thân), các mẫu Ý dĩ ít có sự khác biệt; chú ý đến mẫu Y6 hình dạng lá hẹp hơn hẳn so với các mẫu còn lại, màu sắc lá của mẫu Y1 và Y6 có phần đậm hơn so với các mẫu khác. Về đặc điểm hình thái của các cơ quan sinh sản (hoa, quả , hạt), 7 mẫu Ý dĩ đã ra hoa tại thời điểm báo cáo (tháng 05/2013) có sự khác biệt về các đặc điểm Hình dạng quả (hình bầu dục hay hình cầu), màu sắc vòi nhụy (màu tím hay màu trắng), bề mặt vỏ quả (trơn nhẵn hay xù xì), chiều dài bẹ lá của cụm hoa đầu tiên, đặc điểm vỏ quả (dày hay mỏng); trong đó mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình) quả có hình bầu dục khác với các mẫu còn lại quả có hình cầu. Nghiên cứu này mới chỉ dừng lại ở việc xác định tính đa dạng về hình thái và nông học của 7 mẫu Ý dĩ đã ra hoa tại thời điểm báo cáo (tháng 05/2013). Vì vậy, cần phải tiếp tục theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của 10 mẫu Ý dĩ đến khi thu hoạch, tiến hành xác định lại sự đa dạng của 10 mẫu Ý dĩ về đặc điểm hình thái và nông học.
Dựa và đặc điểm hình thái và nông học 7 mẫu Ý dĩ đã ra hoa gồm Y1, Y2, Y5, Y6, Y7, Y8 và Y9 được chia thành 2 nhóm như trên. Trong 3 mẫu được nghiên cứu lặp lại đã ra hoa gồm Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình), Y7 (Mường Thanh – Điện Biên) và Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn) thì mẫu Y2 có sự khác biệt so với 2 mẫu còn lại, kết
quả này cũng giống với kết quả của nghiên cứu được thực hiện năm 2012 [11]; tuy nhiên sự khác biệt giữa mẫu Y2 so với 2 mẫu Y7 và Y9 là không nhiều với độ tương đồng xấp xỉ 88%, trong khi đó theo nghiên cứu được thực hiện năm 2012 thì sự khác biệt này là rất nhiều [11]. Điều này có thể được giải thích là do nghiên cứu năm 2012 tập trung so sánh các đặc điểm hình thái về thân, lá, hoa, quả, hạt [11], mà ít quan tâm so sánh đến các chỉ tiêu nông – sinh học như Thời gian ra lá đầu tiên, thời gian nảy mầm, chiều cao và số lá của các mẫu Ý dĩ sau mỗi tháng, số lá ở thời điểm ra hoa, số lá ở thời điểm đẻ nhánh, nên kết quả giữa 2 nghiên cứu có sự khác nhau.
Nhìn chung các mẫu được nghiên cứu lặp lại năm 2012 (Bảng 2.1) đều phát triển bình thường khi được gieo trồng tại Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội trong giai đoạn từ tháng 12/2012 đến tháng 05/2013; vì 2 nghiên cứu này được thực hiện trong 2 năm liên tục thời gian không cách xa nhau, nên đặc điểm hình thái của các mẫu Ý dĩ ít có sự thay đổi, chỉ khác nhau ở 1 số chỉ tiêu nông – sinh học như Thời gian nảy mầm, thời gian ra lá đầu tiên, thời gian đẻ nhánh,thời gian ra hoa, sự biến đổi chiều cao theo các tháng và sự biến đổi số lá theo các tháng; có sự khác biệt này là do thời điểm gieo trồng khác nhau (Nghiên cứu năm 2012 các mẫu được gieo vào tháng 08/2011 [11], còn nghiên cứu năm nay các mẫu được gieo vào tháng 12/2012), dẫn đến điều kiện ngoại cảnh khác nhau, mà các chỉ tiêu này phụ thuộc nhiều vào các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa,…
Dựa vào kết quả nghiên cứu tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và kết quả nghiên cứu tính đa dạng về di truyền, ta nhận thấy sự khác biệt về đặc điểm hình thái và nông học không tương đồng với sự khác biệt về di truyền. Kết quả này cũng giống với kết quả của nghiên cứu được thực hiện năm 2012 [11]. Tuy nhiên, xét trong đoạn trình tự khảo sát là ITS1 – 5.8S – ITS2 thì sự khác biệt về trình tự nucleotid giữa các mẫu là không đáng kể (hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu dao động từ 97% đến 99%), nên không có đủ cơ sở để sử dụng đoạn trình tự ITS1 – 5.8S – ITS2 để phân chia các mẫu ở cấp độ dưới loài.
Về thành phần hóa học
Dựa vào kết quả phân tích bằng HPTLC với dịch chiết methanol, các mẫu Ý dĩ có hình dạng peak sắc ký tương đối giống nhau, chỉ sai khác về chiều cao và diện tích peak. Điều này cho thấy các mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học, nhưng có sự sai khác về hàm lượng các hoạt chất có trong mẫu. Kết quả này cũng giống với nghiên cứu của Dược sĩ Nguyễn Kim Khanh tiến hành năm 2012 trên 6 mẫu Ý dĩ với dịch chiết methanol và dịch chiết aceton [11] và nghiên cứu của K. Lakkham được tiến hành năm 2009 trên 4 mẫu Ý dĩ với dịch chiết methanol và dịch chiết aceton [26]. Tuy nhiên, cần lưu ý đến mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan), mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình) và mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La); bởi vì tại Rf = 0,63 mẫu Y5 chứa 1 chất có hàm lượng cao hơn nhiều so với các mẫu còn lại, tại Rf = 0,66 mẫu Y2 chứa 1 chất có hàm lượng cao hơn nhiều so với các mẫu còn lạ, tại Rf = 0,14 mẫu Y1 chứa 1 chất có hàm lượng cao hơn so với các mẫu còn lại. Mặt khác, so với nghiên cứu được tiến hành năm 2012 thì số lượng vết xuất hiện trên sắc ký đồ nhiều hơn; điều này có thể được giải thích là do nghiên cứu này tiến hành chiết hoạt chất trong các mẫu Ý dĩ bằng phương pháp chiết siêu âm, nên trong dịch chiết chứa nhiều chất hơn và có thể chứa cả tạp. Các mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học, điều này gợi ý có thể sử dụng các mẫu Ý dĩ thay thế cho nhau. Tuy nhiên, trong Thực hành tốt trồng cây thuốc (GAP) thì sự sai khác về hàm lượng lại rất quan trọng, do nó ảnh hưởng đến năng suất hoạt chất thu được trên một đơn vị diện tích trồng (trong trường hợp chiết xuất hoạt chất), cũng như hiệu lực điều trị của thuốc (trong trường hợp dùng dịch chiết tổng). Điều này cho thấy việc chọn giống vẫn cần thiết, thậm chí cần lai tạo giống mới để tạo ra giống tối ưu hơn. Nghiên cứu này chỉ mới dừng lại ở xác dịnh dấu vân tay sắc ký, do không có chất chuẩn nên không xác định được chính xác hoạt chất đang quan tâm (Coixan A, B, C; coixenolide và coixol) nằm ở Rf bao nhiêu. Vì vậy cần tiến hành phân tích bằng HPTLC các dịch chiết Ý dĩ đồng thời với các chất chuẩn (Coixan A, B, C; coixenolide và coixol) để đánh giá chính xác hàm lượng của các hoạt chất có trong các mẫu Ý dĩ dựa trên việc so sánh diện tích các vết xuất hiện trên sắc ký đồ giữa mẫu thử và mẫu chuẩn
KẾT LUẬN