1.2.2.1. Khái niệm
Phương pháp giải trình tự gen (DNA sequencing) là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotid trong phân tử DNA.
1.2.2.2. Nguyên tắc Dựa trên 1 trong 2 nguyên tắc sau
- Nguyên tắc hóa học Dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.
- Nguyên tắc enzym học Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ ADN polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotid cùng với các deoxynucleotid thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.
1.2.2.3. Các phương pháp giải trình tự gen
a. Phương pháp Maxam và Gilbert
- Phương pháp này được thực hiện dựa theo nguyên tắc hóa học. - Các bước thực hiện
Bước 1 Đánh dấu phóng xạ 32P ở đầu 5’ của mạch khuôn, biến tính và điện di tách lấy một mạch DNA làm mạch khuôn, cho các xử lý tiếp theo.
Bước 2 Thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu (Bảng 1.1)
Có thể sử dụng 4 – 5 ống nghiệm để thực hiện các phản ứng hóa học đặc hiệu khác nhau.
Bảng 1.1. Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình tự gen bằng phương pháp Maxam và Gilbert
Trong mỗi ống nghiệm có hàm lượng nhất định các mạch đơn DNA khuôn đã đánh dấu phóng xạ, được xử lý hóa học đặc hiệu khác nhau, tạo các đoạn DNA dài ngắn khác nhau.
Bước 3 Lấy sản phẩm xử lý trong mỗi ống nghiệm đem chạy điện di, hiện hình phóng xạ và xác định kết quả.
Bước 4 Tập hợp kết quả thu được ở tất cả các ống nghiệm, thu được các đoạn polynucleotid dài ngắn hơn kém nhau 1 nucleotid, từ đó xác định được trình tự của mạch DNA khuôn.
Phương pháp xác định trình tự nucleotid bằng các phản ứng hóa học đặc hiệu của Maxam và Gilbert có độ chuẩn xác kém, cần phải thực hiện nhiều lần và loại bỏ các sai sót để chọn một kết quả gần đúng nhất. Do đó, phương pháp Maxam và Gilbert ít được ứng dụng trong thực tiễn.
b. Phương pháp enzym học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid của Sanger và cộng sự
- Phương pháp này được thực hiện theo nguyên tắc enzym học. - Các bước thực hiện
Ống Xử lý đặc hiệu Vị trí cắt
1 Dimethyl sunfat Cắt tại G
2 Acid PH = 2 Cắt tại A và G
3 Hydrazin Cắt tại C và T
4 Hydrazin + NaCl Cắt tại C
Bước 1 Biến tính DNA khuôn, điện di trên gel polyacrylamid (có bổ sung ure) để thu các mạch đơn DNA.
Bước 2 Chuẩn bị phản ứng tổng hợp DNA
Lấy bốn ống Eppendorf, cho các thành phần cần thiết vào mỗi ống (Mạch khuôn, mồi có đánh dấu phóng xạ, enzym ADN polymerase và dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) và dung dịch đệm thích hợp). Thêm vào mỗi ống tương ứng một lượng nhỏ (khoảng 1%) một loại ddNTP nhất định Ống 1 bổ sung 1% ddATP, ống 2 thêm 1% ddTTP, ống 3 thêm 1% ddGTP và ống 4 thêm 1% ddCTP.
Bước 3 Thực hiện phản ứng tổng hợp DNA với các thiết bị tuần hoàn nhiệt.
Bước 4 Điện di kết quả, so sánh các kết quả các chuỗi mạch đơn DNA được tổng hợp để xác định trình tự của mạch khuôn.
Tổng hợp kết quả ở 4 ống, thu được các đoạn mạch đơn hơn kém nhau một nucleotid, thu được trình tự đoạn mạch đơn mới được tổng hợp và xác định được trình tự của mạch DNA khuôn.
Phương pháp giải trình tự gen do F.Sanger và cộng sự phát minh có độ chính xác tương đối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự động.
c. Giải trình tự DNA bằng máy tự động (Sequencer)
- Nguyên tắc Máy giải trình tự gen bán tự động hoặc tự động hoàn toàn được thiết kế trên nguyên tắc sử dụng ddNTP do F.Sanger và cộng sự phát minh.
Trong quá trình tổng hợp DNA có sử dụng các mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang thay cho đánh dấu phóng xạ, mỗi loại dNTP được đánh dấu huỳnh quang khác nhau, biểu thị các màu sắc khác nhau.
Máy thực hiện tổng hợp các mạch đơn DNA mới trên cả 2 mạch khuôn DNA đồng thời sử dụng các phần mềm tính toán trên máy tính để xử lý kết quả giúp kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao.
- Các bước thực hiện
Bước 1 Chuẩn bị DNA khuôn, DNA khuôn phải đảm bảo độ tinh sạch cao, có kích thước thích hợp (thường sử dụng các mẫu DNA đã được tách dòng
để có độ chính xác cao).
Bước 2 Chuẩn bị các điều kiện cần thiết cho phản ứng tổng hợp DNA (theo protocol của các hãng cung cấp hóa chất hoặc thiết bị...) và thực hiện nhân
DNA bằng thiết bị PCR.
Bước 3 Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự gen và chạy máy giải Trình tự gen. Trong quá trình máy hoạt động các nucleotid được kiểm soát nhờ detecter báo về bộ phận xử lý của máy tính, phần mềm xử lý kết quả và vẽ đồ thị của các loại nucleotid đi qua detecter.
Bước 4 Phân tích kết quả từ các dữ liệu do máy tính cung cấp, so sánh kết quả xác định trình tự ở cả 2 mạch đơn mới, đồng thời căn cứ vào đồ thị để sửa các sai sót và chọn kết quả đúng nhất.