1. Giới thiệu chung về ty thể
3.2. Nhân gen bằng phương pháp PCR
Vùng D – Loop được chọn nghiên cứu. Cặp mồi dùng cho phản ứng PCR bao gồm mồi xuôi: định vị trên RNA vận chuyển Proline (RNAvPro) và mồi ngược: định vị trên vùng bảo tồn D – Loop, nhân đoạn ADN cho độ dài xấp xỉ 1000 cặp nucleotit . Chúng tôi dùng trình tự hệ gen ty thể người được công bố tại Ngân hàng Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để thực hiện các bước thiết kế mồi và so sánh trình tự.
Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn nucleotit mạch đơn có kích thước từ 6 – 100 bp, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn ở 2 đầu mạch đơn. Có 2 loại mồi là mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse) tham gia vào PCR.
đảm bảo kết quả PCR tốt nhất, mồi xuôi và mồi ngược phải có trình tự không bổ sung với nhau nhằm tránh xảy ra hiện tượng tự bắt cặp giữa các mồi với nhau. Các mồi có Tm (Melting Temperature) gần giống nhau thì hiệu quả phản ứng được tăng cường, khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược nhỏ hơn 1 kb là thích hợp nhất.
Để nhân đoạn gen, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi dựa trên trình tự gen ty thể đã được công bố trong Ngân hàng Gen quốc tế (GeneBank), số đăng ký J01415, trình tự này cũng được gọi là trình tự Anderson.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
361 acaaagaacc ctaacaccag cctaaccaga tttcaaattt tatcttttgg cggtatgcac 421 ttttaacagt caccccccaa ctaacacatt attttcccct cccactccca tactactaat 481 ctcatcaata caacccccgc ccatcctacc cagcacacac acaccgctgc taaccccata 541 ccccgaacca accaaacccc aaagacaccc cccacagttt atgtagctta cctcctcaaa
601 ccactcacgg gagctctcca tgcatttggt attttcgtct ggggggtgtg cacgcgatag
661 cattgcgaga cgctggagcc ggagcaccct atgtcgcagt atctgtcttt gattcctgcc 721 tcatcctatt atttatcgca cctacgttca atattacagg cgaacatact tactaaagtg 781 tgttaattaa ttaatgcttg taggacataa taataacaat tgaatgtctg cacagccgct 841 ttccacacag aaaaaatttc acatcataac caccaaaccc cccccctccc cccgcttctg 910 gccacagcac ttaaacacat ctctgccaaa ccccaaaaac aaagaaccct aacaccagcc 15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga
15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct
16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat.
Theo tính toán trên, cặp mồi thiết kế sẽ nhân bản đoạn DNA trong vùng D – Loop với kích thước khoảng 1000 bp.
Cặp mồi thiết kế như sau:
Primer forward (LF): 5’ - cac cattagcacc caaagct - 3’ Primer reverse (LR): 5’ – ctgttaaaagtgcataccgcca - 3’
Để nhân đoạn ADN đặc hiệu, có số lượng lớn thì ngoài việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu còn phải có các thành phần hỗn hợp của PCR và chu trình nhiệt tối ưu. Chúng tôi đã thử các điều kiện khác nhau để tìm ra điều kiện PCR tối ưu. Bảng 7 và 8 dưới đây là thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phù hợp để nhân đoạn ADN liên quan.
L15977 H408
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho một phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Master Mix 2X 12.5 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1 ADN khuôn 1 Nước 9.5 Tổng 25
Các ống phản ứng này sau đó sẽ được đặt vào máy chạy PCR với chu trình nhiệt như bảng 3.3.
Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Bắt cặp 57 1 phút ×30
4 Kéo dài 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
6 Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.1).
Hình 3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng D – Loop
Kết quả điện di ở hình 3.1 cho thấy bản gel sản phẩm PCR có dạng 1 băng ADN duy nhất, đậm và rõ nét, có kích thước là 1000 bp phù hợp với kích thước của đoạn ADN cần nhân.