1. Giới thiệu chung về ty thể
3.3. Kết quả giải trình tự gen
Sản phẩm PCR đặc hiệu sau khi đã tinh sạch được đọc trình tự gen trên máy đọc tự động, sử dụng hai mồi đọc trình tự là mồi L15977 xuôi và mồi H408 ngược.
Trình tự các đoạn gen đặc hiệu được xác định theo phương pháp của Sanger bằng máy
giải trình tự gen trên máy ABI Prism 3100 Avant của hãng First Base tại Singapore
(tốc độ 2,5 giờ/4 mẫu ~ 4000 nucleotit).
Kết quả được phân tích sử dụng chương trình phần mềm Genedoc và phần mềm BioEdit. Các trình tự có tín hiệu nhiễu được kiểm tra lại hoặc loại bỏ khỏi các phân tích tiếp theo. Trình tự nucleotit được so sánh với trình tự nucleotit của các đoạn ADN khác trong Ngân hàng Gen (http://www.ebi.ac.uk) bằng chương trình EMBL FASTA. Hình 3.2 trình bày một số ví dụ điển hình của các mẫu đọc trình tự.
Hình 3.2. Kết quả giải trình tự trên một số mẫu sinh phẩm 3.4. Kết quả phân tích đột biến
trừ hoặc tập hợp các đột biến, chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh trình tự hoặc dùng phần mềm chuyên dụng cho việc xác định đột biến NovoSNP.
3.4.1. Các SNPs được công bố trên Ngân hàng Gen
Chúng tôi đã tiến hành tìm các vị trí đa hình (SNPs) của HV1 trong vùng D – Loop của hệ gen ty thể người đã được công bố trên Ngân hàng Gen từ trang web
http://mitomap.org. Bảng danh sách này liệt kê 76 SNPs từ vị trí 16192 đến 16368 được sử dụng như danh sách tham chiếu để so sánh với danh sách SNPs ở nhóm người Việt Nam trong nghiên cứu này. Các thông tin về SNPs được thống kê trên website trên gồm nhiều vùng khác nhau trong gen ty thể. Tuy nhiên trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu vùng HV1 của D – Loop, chính vì thế bảng 3.4 này chỉ có thông tin về: Vị trí SNP, locus, vùng gen, nucleotit thay đổi của vùng siêu
biến HV1, còn các SNP ở vùng khác thì tham khảo thêm ở http://mitomap.org.
Bảng 3.4. Vị trí đa hình HV1 trong vùng D – Loop được công bố trên Ngân hàng Gen
3.4.2. Các vị trí đa hình (SNPs) ở HV1 trong vùng D – Loop của người Việt Nam
Sau khi việc giải trình tự các mẫu sinh phẩm có kết quả, việc tiếp theo là chúng tôi phân tích và tìm kiếm các SNPs của người Việt Nam sử dụng phần mềm NovoSNP
(Bỉ) http://www.molgen.ua.ac.be/bioinfo/novosnp. NovoSNP là một phần mềm dễ sử
dụng và có tính hiệu quả cao, cho kết quả đáng tin cậy đối với sự phát hiện các biến thể trình tự ở cả các SNP và INDELS, cũng như trong việc chọn lọc các biến thể trình tự đối với đột biến gây bệnh hoặc là phát hiện SNP. Người ta cũng đã so sánh các đột biến được phát hiện ở phần mềm này với 2 phần mềm PolyPhred và PolyBayes, kết quả cho thấy các giá trị chọn lọc cao có thể dùng để xây dựng bản đồ SNP.
Hình 3.3. Phần mềm NovoSNP khi phân tích mẫu
Dựa trên kết quả phân tích thông qua phần mềm NovoSNP đã tìm được 44 vị trí đa hình từ 16194 đến 16359 trong vùng HV1 của người Việt Nam. Xem bảng 3.5.
Bảng 3.5. SNPs được tìm thấy trong HV1 ở mẫu sinh phẩm Việt Nam (NovoSNPS)
Ở bảng 3.5 dễ nhận thấy giá trị Score và Fscore càng cao thì khả năng đa hình càng chính xác. Theo kết quả nêu tại Bảng 3.5 dựa trên thuật toán của phần mềm NovoSNP thì tại vị trí 16194, giá trị Score: 66 và Fscore: 51 là tương đối cao. Điều này cho thấy khả năng chèn Nucleotit C (Insert C) vào vị trí này là rất cao trong các đối tượng người Việt Nam tham gia nghiên cứu này. Điều này còn được thể hiện rõ hơn qua hình 3.3 sau khi so sánh với trình tự rCRS sử dụng NovoSNP. Điểm chèn Nucleotit C ở vị trí 16194 xảy ra ở hầu hết các trình tự của những mẫu tham gia (vị trí được đánh dấu màu đỏ trong hình 3.4). Tuy nhiên ở đây chúng tôi không liệt kê ra hết các trình tự mà chỉ đưa ra một số trình tự tiêu biểu kể cả những trình tự có giá trị Score: 16 và Fscore: 16, thấp hơn rất nhiều so với vị trí 16194 nhưng NovoSNP cũng đã đưa ra được tính đa hình cao và đảm bảo độ tin cậy như tại vị trí 16381 thay đổi Nucleotit T →A (vị trí được đánh dấu màu đỏ như trong hình 3.5). (Stefan Weckx và cộng sự. 2005).
Hình 3.5. SNP tại vị trí 16381
3.4.3. So sánh danh sách SNPs người Việt Nam và danh sách SNPs thống kê trên GenBank GenBank
Để so sánh tìm ra điểm đa hình chung và riêng của nhóm người Việt Nam trong nghiên cứu này và danh sách các điểm đa hình công bố trên Ngân hàng Gen, chúng tôi đã lập bản đồ Venn để thể hiện rõ rệt. Kết quả là có 33 vị trí đa hình là giống nhau, 43 SNP của trình tự người được công bố trên Ngân hàng Gen (J và 11 SNP đặc trưng của nhóm người Việt Nam trong nghiên cứu. Hình 3.6.
Hình 3.6. Bản đồ Venn tìm điểm đặc trưng và riêng của người Việt Nam
Danh sách các SNP đặc trưng của nhóm người Việt Nam được tìm thấy trong nghiên cứu, thống kê trong bảng 3.6 dưới đây.
Bảng 3.6. Các SNP đặc trưng ở người Việt Nam
Các SNP trong vùng HV1 của người Việt Nam
Số thứ tự Vị trí Số thứ tự Vị trí 1 16194 7 16312 2 16195 8 16314 3 16206 9 16359 4 16232 10 16366 5 16240 11 16381 6 16302
3.5. Các vị trí đa hình đặc trưng ở người Việt Nam và bệnh ty thể
11 SNPs được liệt kê ở bảng trên không chỉ giúp chúng ta xác định được đột biến đặc trưng ở người Việt Nam, ngoài ra còn mang lại các thông tin các đột biến này có liên quan gì đến các bệnh di truyền ty thể như ung thư dạ dày, ung thư bàng quang, Huntington v..v…để dùng làm tài liệu nghiên cứu đóng góp cho lĩnh vực y học, phát hiện sớm các bệnh di truyền và điều trị kịp thời. Dưới đây là bảng liệt kê các bệnh liên quan đến đột biến ty thể nằm trong vùng HV1 đặc trưng ở người Việt Nam.
Năm 2014, Mousavizadeh K và cộng sự đã công bố bài báo về ảnh hưởng của các đột biến liên quan đến bệnh Huntington xảy ra trong vùng điều khiển D – Loop trên 30 bệnh nhân Huntington và 463 người khỏe mạnh sử dụng phương pháp giải trình tự sản phẩm PCR. Kết quả sau khi phân tích trình tự và so sánh với trình tự tham chiếu Cambridge cho thấy các đa hình tại các điểmC16069T, T16126C, T16189C, T16519C và C16223T có liên quan đến mối đe dọa tăng khả năng mắc bệnh
Huntington, trong khi các SNP tại các vị trí C16150T, T16086C và T16195Ccó liên quan đến khả năng giảm bệnh Huntington.
Nasser Shakhssalim và cộng sự. 2013 đã nghiên cứu về SNP tại vị trí 16194 ở HV1 trong vùng D – Loop, kết quả cho thấy đột biến điểm này có liên quan đến căn bệnh ung thư bàng quang.
Đột biến điểm tại vị trí 16312 có ảnh hưởng lớn đến Hội chứng đột tử ở trẻ và công trình này đã được Opdal và cộng sự công bố vào năm 1998.
Bảng 3.7. Một số bệnh ty thể liên quan đến đột biến điểm trong vùng HV1 STT Vị trí Bệnh liên quan PMID Tác giả Tạp chí, năm
1 16194 Ung thư bàng
quang
3930351 Nasser
Shakhssalim và cộng sự
Cancer cell int December2013 2 16195 Huntington 24471944 Mousavizadeh K và cộng sự Mitochondrial DNA Epub 2014 Jan 19
3 16206 Chưa có thông tin
liên quan
4 16232 Chưa có thông tin
liên quan
5 16240 Chưa có thông tin
liên quan
6 16302 Chưa có thông tin
liên quan
7 16312 SIDS 9825969 Opdal SH
và cộng sự
Acta Paediatr 1998 Oct
8 16314 Chưa có thông tin
liên quan
9 16359 Chưa có thông tin
liên quan Chưa có thông tin
liên quan
11 16381 Chưa có thông tin
liên quan
*Chú thích: SIDS – Sudden Infant Death Syndrome: Hội chứng đột tử ở trẻ em.
3.6. Phần trăm đa hình trong mẫu phân tích
Hình 3.7. Kết quả phân tích đột biến trên nhóm người Việt Nam nghiên cứu
Dựa vào kết quả phân tích như trong hình 3.6, chúng tôi đưa ra được bảng phần trăm các vị trí đa hình của 11 điểm SNP đặc trưng ở nhóm người Việt Nam trong nghiên cứu này. Bảng 3.8.
Từ bảng 3.8 có thể thấy rằng tại một số điểm có thể xảy ra đột biến thay đổi từ nucleotit này thành 1 nucleotit khác hoặc cũng có thể có 2 vị trí thay thế như tại điểm 16312, 16359, 16381, 16194 hoặc 16195.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Tách thành công ADN tổng số từ móng tay.
2. Nhân thành công đoạn gen vùng D – Loop có kích thước khoảng 1000bp với
cặp mồi L15977 và H408.
3. Từ 76 SNP đã công bố trên Ngân hàng Gen so sánh với SNPs của nhóm người
Việt Nam trong nghiên cứu cho thấy có 33 SNP chung và 11 SNP đặc trưng của nhóm người Việt Nam, trong số đó có một vài SNP có liên quan đến các bệnh ty thể đã được công bố trên thế giới.
KIẾN NGHỊ
1. Kết quả trên mới chỉ là nghiên cứu trong phạm vi HV1 của vùng D – Loop, tuy
nhiên trong vùng điều khiển có cả vùng HV2, HV3 cũng là các vùng có tần suất đột biến cao, nhiều “hotspot” chính vì thế có thể mở rộng nghiên cứu thêm các vùng trên. Ngoài ra vùng mã hóa của ADN ty thể cũng có một số SNP liên quan đến y học cần được mở rộng nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol
4:289-333.
2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell. 4th edition, Garland Science; 2002. Garland Science; 2002.
3. Barthelemy, C., de Baulny, H. O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in
mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):479-
87.
4. Berger, K. H., and Yaffe, M. P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance,
Experientia 52(12):1111-6.
5. Bowmaker, M., Yang, M. Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H. T., Huberman, J. A., and Holt, I. J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an and Holt, I. J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9.
6. Brown, T. A., Cecconi, C., Tkachuk, A. N., Bustamante, C., and Clayton, D. A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light- Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-
strand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76.
7. Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O. (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser
fluorescence. J. Chromatogr. B 658: 271-280
8. Butler, J.M. and Levin, B.C. (1998) Forensic applications of mitochondrial
DNA. Trends in Biotechnology 16: 158-162
9. Chen, X. J., and Butow, R. A., 2005, The organization and inheritance of the
mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25.
10. Cheng, Y. L., Chang, W. L., Lee, S. C., Liu, Y. G., Chen, C. J., Lin, S. Z., Tsai, N. M., Yu, D. S., Yen, C. Y., and Harn, H. J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits Yu, D. S., Yen, C. Y., and Harn, H. J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci
11. Clayton, D. A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life
55(4-5):213-7.
12. Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland.
13. Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G. J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the
mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9.
14. Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s.
15. Evan, G. I., and Vousden, K. H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8.
16. Fliss, M. S., Usadel, H., Caballero, O. L., Wu, L., Buta, M. R., Eleff, S. M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9.
17. Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M. C., 1992, Identifying individuals by
sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8.
18. Goldstein, S., and Shmookler Reis, R. J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30.
19. Greenberg, B. D., Newbold, J. E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA,
Gene 21(1-2):33-49.
20. Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70.
Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):1367-
80.
21. Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013,
22. IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release.
23. Lu, J., Sharma, L. K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA
mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15.
24. Majamaa, K., Moilanen, J. S., Uimonen, S., Remes, A. M., Salmela, P. I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K. A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K. J., and Hassinen, I. E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population,
Am J Hum Genet 63(2):447-54.
25. McFarland, R., Elson, J. L., Taylor, R. W., Howell, N., and Turnbull, D. M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is
not good enough, Trends Genet 20(12):591-6.
26. McKinney, E. A., and Oliveira, M. T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA,
Genet Mol Biol 36(3):308-315.
27. Miyazono, F., Schneider, P. M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S. E., Dienes, H. P., Aikou, T., and Hoelscher, A. H., 2002, Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus,
Oncogene 21(23):3780-3.
28. Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M. J., Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S., Hirschhorn, J. N., Altshuler, D., and Groop, L. C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes,
Nat Genet 34(3):267-73.
29. Moraes, C. T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C.,
Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev
30. Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and
diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(1-
2):14-21.
31. Nass, M. M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I. Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611.
32. Parkin, D. M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606.
33. Petersen, K. F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D. L., DiPietro, L., Cline, G. W., and Shulman, G. I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2.
34. Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J. K., Markowitz, S. D., Trush, M. A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial
genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3.
35. Ralph, S. J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced
oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects
Med 31(2):145-70.
35. Reed, J. C., and Green, D. R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3.
36. Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C
Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta
81:448-61.
37. Shoubridge, E. A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum
Mol Genet 10(20):2277-84.
38. Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures. V. Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63.
39. Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty thể control region are