II. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu – Hóa chất nghiên cứu
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp thu mẫu đất
Địa điểm thu mẫu đƣợc định vị tại vùng rễ của các cây Dó bầu khỏe mạnh từ 5 đến 7 năm tuổi. Các mẫu đất đƣợc thu thập vào cùng một thời điểm vào mùa khô tháng 8 năm 2013. Tại các vị trí lấy mẫu, phần đất bề mặt đƣợc loại bỏ. Đất tại vùng rễ đƣợc thu thập bằng cách đào tại độ sâu khoảng 30 cm. Tại mỗi khu vực lấy mẫu khoảng 25 m2 gồm khoảng 3 cây dó bầu, chúng tôi tiến hành lấy mẫu đất tại 9 vị trí nhƣ trên hình.
Hình 2.2. Vị trí tiến hành thu mẫu tại một khu vực nghiên cứu Sau khi loại bỏ toàn bộ các viên đá lớn, đất tại 9 vị trí trong 1 khu vực đƣợc gộp làm một, trộn đều, và sau đó chuyển vào các ống corning 50 ml. Mẫu
Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường
đất đƣợc bảo quản trong điều kiện tối và ở -20o
C tới khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Các mẫu đất thu tại các vùng trồng dó bầu đƣợc tiến hành tách chiết DNA bằng bộ Kit PowerSoil® DNA Isolation. DNA sau khi tách thành công đƣợc tiến hành do nồng độ và độ tinh sach bằng máy Nano drop, kiểm tra bằng điện di trên agarose 1% và bảo quản ở -20o
C.
B1: Thêm 0,25 gam mẫu đất vào ống PowerBead B2: Lắc hoặc vortex để trộn đều mẫu
B3: Kiểm tra Giải dung dịch C1. Nếu C1 bị kết tủa, ủ ở 60 C cho đến khi tan trƣớc khi sử dụng
B4: Thêm 60 l dung dịch C1 và đảo ngƣợc nhiều lần hoặc lắc thời gian ngắn.
B5: vortex 5-10p tốc độ tối đa
B6: ly tâm 10.000g 30s ở nhiệt độ phòng, lƣu ý nếu li tâm > 10.000g có thể ống sẽ vỡ
B7: Chuyển nổi sang ống 2 ml, thể tích mong muốn khoảng 400-500 µl B8: Thêm 250 l đệm C2 và lắc trong 5 giây. Ủ ở 4 C trong 5 phút B9: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 1 phút 10.000 x g
B10: chuyển dịch nổi sang ống 2 ml nhƣng không nhiều hơn 600 l
B11: Thêm 200 l đệm C3 và vortex một thời gian ngắn. Ủ ở 4 C trong 5 phút
Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường
B13: chuyển dich nổi vào ống 2 ml không nhiều quá 750 l
B14: Lắc để trộn đệm C4 trƣớc khi sử dụng. Thêm 1200 l đệm C4, lắc hoặc vortex 5 giây
B15: cho 675 l vào bộ lọc Spin và ly tâm ở 10.000 xg trong 1 phút ở
nhiệt độ phòng, đổ dich qua cột và lặp lại cho đến hết dung dịch
B16: Thêm 500 l đệm C5 ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 xg
B17: Loại bỏ các phần dung dịch qua qua cột
B18: Ly tâm một lần nữa ở nhiệt độ phòng trong 1 phút ở 10.000 xg B19: chuyển thận đặt bộ lọc sang ống 2 ml sạch
B20: Thêm 100 l đệm C6
B21: Ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 30 giây ở 10.000 x g.
2.2.3.Phương pháp xác định trình tự vùng 16S RNA
Theo Zuckerkand and Pauling (1965) cho rằng các phân tử sinh học có thể là “thƣớc đo tiến hóa” và chúng có các đặc điểm sau: phân tử có mặt ở tất cả các sinh vật; phân tử không đƣợc truyền qua lại giữa các loài; trình tự của các phân tử này phải có độ bảo tồn và biến động thích hợp với khoảng cách tiến hóa; phân tử phải có kích thƣớc đử lớn để chứa nhiều thông tin. Một thập kỷ sau đó Woese et al. (1977) đã xác định đƣợc 16S là phân tử thích hợp làm thƣớc đo tiến hóa: 16S là phân tử cổ, chức năng không thay đổi, phân bố ở hầu hết các hệ thống sống và có độ bảo tồn vừa phải.
Trình tự mồi: các mồi đƣợc sử dụng trong nghiên cứu để khuếch đại vùng
Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân hai vùng V3 và V4 (16S Illumina primers)
Têm mồi 5’-3’ primer Kích thƣớc 16S F TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 50 bp 16S R GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAG AGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC 55 bp Thành phần phản ứng PCR: Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR để nhân hai vùng V3 và V4 Thành Phần Thể tích DNA vi sinh vật (5 ng/µl) 2,5 µl
Mồi xuôi 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl Mồi ngƣợc 16S Amplicon PCR 1 µM 5 µl 2X KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12,5 µl
Tổng 25 µl Chu trình PCR: 95oC 55oC 72oC 72oC 4oC 30 giây 30 giây 30 giây 5 phút 25 chu kỳ 3 phút 95oC
Luận văn Thạc sĩ Hồ Mạnh Tường
Hình 2.3. Chu trình PCR nhân phân đoạn V3 và V4 trên phân tử 16S rRNA
Bổ sung 1 µl sản phẩm PCR vào Bioanalyzer DNA 1000 chip để kiểm định kích thƣớc. Kích thƣớc dự kiến sau khuếch đại là 550 bp. Sau khi kiểm tra các sản phẩm đƣợc khuếch đại theo đúng tính toán lý thuyết, các sản phẩm này sẽ đƣợc tiến hành tinh sạch để phục vụ cho bƣớc tiếp theo.
2.2.4. Gắn Adapter
Các mẫu sau khi tách chiết DNA sẽ đƣợc gắn các adapter để phân biệt đƣợc chúng trong qua trình xử lý kết quả. Adapter sẽ đƣợc gắn theo bộ kit Nextera XT Index kit và theo quy trình sau:
Thành phần phản ứng:
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn adapter
Thành Phần Thể tích
DNA 5 µl
Nextera XT Index Primer 1 5 µl Nextera XT Index Primer 2 5 µl 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25 µl
Nƣớc khử ion 10 µl
Tổng 50 µl
Chạy PCR với chu trình phản ứng:
95oC 72oC 72oC