3. Nội dung nghiên cứu
3.2. Xác định trình tự gen CrPrx
Gen CrPrx được nhân lên bằng cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI mang điểm cắt của enzyme giới hạn NcoI/NotI. Nhưng chỉ bằng hình thức PCR và cắt bằng enzyme giới hạn đã được thực hiện ở trên vẫn chưa thể kết luận chắc chắn rằng đoạn gen được phân lập là gen CrPrx, có thể là đoạn gen nào khác có gần kích thước bắt cặp với mồi. Vì vậy, để có thể kết luận một cách
chính xác nhất chúng tôi tiếp tục mang đi giải trình tự và so sánh với trình tự đã công bố tại Ngân hàng Gen quốc tế mang mã số LN809932.
Hình 3.5: So sánh trình tự nucleotid của gen CrPrx với trình tự gen mang mã số LN809932
Kết quả so sánh gen bằng phần mềm BioEdit cho thấy, CrPrx phân lâ ̣p từ mRNA cây dừa cạn hoa hồng tím được PCR bằng cặp mồi có điểm cắt của enzyme cắt giới hạn so với trình tự gen Prx của cây dừa cạn đã công bố tại Ngân hàng gen Quốc tế mang mã số LN809932 đều có kích thước 993 bp.
Trình tự gen CrPrx so sánh với trình tự gen đã công bố có mã số LN809932có độ tương đồng rất cao (đạt 98%).
Tuy nhiên, trình tự nucleotide CrPrx phân lập t ừ mRNA cây hoa hồng tím so với trình tự mang mã số LN809932 có 18 vị trí sai khác (12, 25, 33, 68, 69, 133, 143, 283, 289, 317, 334, 336, 398, 704, 756, 757, 976. 985).
Bảng 3.1: Vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự gen CrPrx và LN809932
STT Vị trí CrPrx LN809932 1 12 A T 2 25 T C 3 33 T G 4 68 A T 5 69 C T 6 133 A G 7 143 T G 8 283 A G 9 289 T G 10 317 C G 11 334 G A 12 336 - A 13 398 - C 14 704 C T 15 756 G A 16 757 A C 17 976 T G 18 985 T A
Như vậy, chúng tôi đã phân lập, tách dòng thành công và giải trình tự đoạn gen CrPrx phân lập từ mẫu cây dừa ca ̣n hoa hồng tím thu ta ̣i Thái Nguyên
3.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen CrPrx
Cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc-DKEL được cắt bằng enzyme giới hạn từ vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx, sau đó gắn vào pBI121 đã cắt mở vòng và chuyển vào E. coli DH5α. Các vector tái tổ hợp này được tách plasmid và kiểm tra bằng cách sử dụng enzyme giới hạn HindIII.
Gen CrPrx đã phân lập từ cây dừa cạn hoa hồng tím được đưa vào thiết kế vector gồm các trình tự xác định chuỗi peptide tín hiệu (SP) và hai vùng chức năng I và II.
Hình 3.6: Sơ đồ thiết kế vector pBI121-CrPrx
Vector pRTRA7/3 được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi do có chứa đoạn trình tự quan tâm là CaMV35S, Cmyc và KDEL. CaMV35S là một promoter rất mạnh giúp cho gen biểu hiện mạnh trong cây. Cmyc và KDEL là thành phần cần thiết để gen chuyển vào được cây. Gen CrPrx được ghép nối vào vector pRTRA7/3 đã được cắt mở vòng chứa các đoạn trình tự cần quan tâm. Tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx phục vụ nghiên cứu thiết kế vector mang cấu trúc CrPrx.
3.3.1.Tạo cấu trúc chứa gen đích CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc)
Vector trung gian pRTRA7/3 được dùng để cung cấp các thành phần cần thiết cho việc biểu hiện và kiểm tra gen đích CrPrx trong tế bào thực vật như: (1) CaMV35S là promoter mạnh phân lập từ virus khảm súp lơ, có thể khởi động phiên mã gen chuyển ở tất cả các tế bào và mô trên cơ thể thực vật; (2) có đuôi polyA giúp ổn định cấu trúc phân tử mRNA trong tế bào chất; (3) đặc biệt pRTRA7/3 còn cung cấp trình tự xác định chuỗi peptide Cmyc kháng nguyên để có thể dễ dàng xác định sự có mặt của sản phẩm protein đích khi dùng kháng thể tương ứng bằng Western blot hoặc ELISA.
Dựa vào kích thước gen CrPrx đã trình bày ở phần 2.1.1 lựa chọn thôi gel và tinh sạch. Gen CrPrx cắt bằng enzyme giới hạn NcoI/NotI được trình bày ở phần 3.1.2.3 (hình 3.4).
Cắt mở vòng vector pRTRA 7/3
Vector pRTRA7/3 là vector trung gian, trên vector này vừa có hai điểm cắt của enzyme giới hạn là NcoI và NotI vừa có trình tự nhận biết của HindIII. Nhưng gen CrPrx trình bày ở phần 3.1.2.3 cắt bằng cặp enzyme giới hạn
NcoI/NotI. Mục đích của bước này là đưa được gen CrPrx vào vector trung gian pRTRA7/3. Vì vậy, pRTRA7/3 bắt buộc phải sử dụng enzyme NcoI/NotI để tạo đầu nối giữa pRTRA7/3 và CrPrx.
Theo tính toán lý thuyết, nếu sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI và NotI cắt vector pRTRA7/3 thì thu được hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 0,9 kb (là đoạn 2SP và antiABA không sử dụng) và 3,3 kb (kích thước của vector pRTRA7/3). Trong đó, phân đoạn 3,3 kb chính là đoạn pRTRA7/3 đã mở vòng mang các trình tự cần thu nhận để phát triển vector tái tổ hợp.
Kết quả điện di ở hình 3.7A cho thấy, sau khi cắt mở vòng pRTRA7/3 bằng enzyme NcoI/NotI thu được hai phân đoạn 0,9 kb và 3,3 kb đúng như lý thuyết. Phân đoạn có kích thước 3,3 kb được thôi gel để thu nhận cấu trúc mở vòng của pRTRA7/3. Sản phẩm được mang đi thôi gel thu nhận được một băng duy nhất có kích thước như ước tính khoảng 3,3 kb (hình 3.7B), sản phẩm này dùng để phục vụ phát triển vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx
Hình 3.7: Đoạn DNA đích đã tinh sạch từ pRTRA7/3 cắt mở vòng bằng
NcoI/NotI
A. Sản phẩm điện di plasmid cắt bằng NcoI/NotI
(1) Plasmid pRTRA7/3 không xử lý bằng enzyme (đối chứng) (2) Plasmid pRTRA7/3 sau khi xử lý bằng enzyme NcoI/NotI
B. Sản phẩm tinh sạch vector pRTRA7/3 sau khi thôi gel M: Thang DNA 1kb chuẩn; 1: Vector pRTRA7/3 tinh sạch
Gắn gen CrPrx vào vector mở vòng pRTRA7/3
Gen CrPrx mang đầu dính của cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI được gắn vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ phản ứng ghép nối với sự xúc tác của T4 ligase tạo ra vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx. Vector này được biến nạp vào
tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin. Kiểm tra các dòng khuẩn lạc bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI.
Hình 3.8: Kết quả PCR các dòng khuẩn lạc từ plasmid tái tổ hợp
pRTRA7/3-CrPrx
M: Thang DNA 1kb chuẩn
1 - 5: Các dòng khuẩn lạc pRTRA7/3-CrPrx
Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, trong 5 dòng khuẩn lạc có 4 dòng (2, 3, 4, 5) xuất hiện băng DNA đặc hiệu khoảng 1 kb tương ứng với kích thước của gen CrPrx. Như vậy, 4 dòng khuẩn lạc được chọn lọc mang plasmid tái tổ hợp mang gen CrPrx. Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx được sử dụng để thu nhận cấu trúc mang gen CrPrx phục vụ phát triển vector chuyển gen ở thực vật.
3.3.2. Gắn cấu trúc chứa gen CrPrx vào vector pBI121
Sau khi tạo được cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) đầy đủ các thành phần cần thiết cho biểu hiện và kiểm tra hoạt động của gen, việc tiếp theo là gắn cấu trúc này vào vector chuyển gen phù hợp để có thể biến nạp được vào hệ gen thực vật. Vector pBI121 được lựa chọn vì mang những đặc điểm như là có điểm cắt của enzyme giới hạn phù hợp, giữa bờ trái (LB) và bờ phải (RB) có gen kháng kanamycin hoạt động trong tế bào thực vật nhờ Nos promoter và Nos terminator, có điểm khởi động tái bản oriV trong vi khuẩn, có gen chọn lọc kháng kanamycin hoạt động trong vi khuẩn, có operon TrfA mang các gen vir đảm nhiệm quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào hệ gen thực vật và một số thành phần khác.
Việc ghép nối cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen pBI121 được thực hiện bởi các phản ứng là thu nhận cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc- KDEL-polyA bằng enzyme giới hạn từ pRTRA7/3-CrPrx, cắt mở vòng vector pBI121. Sau đó, ghép nối cấu trúc gen CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào vector pBI121 đã mở vòng tạo vector chuyển gen ở thực vật.
Thu nhận cấu trúc vector tái tổ hợp chứa gen CrPrx và cắt mở vòng pBI121
Cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 bằng enzym cắt giới hạn
HindIII
Gen CrPrx và các thành phần CaMV35S, Cmyc, KDEL và polyA có kích thước là 1844 bp, ở hai đầu là điểm cắt của enzyme giới hạn HindIII. Xử lý vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII thu nhận được cấu trúc mang gen CrPrx dài 1844 kb và phần còn lại của vector pRTRA7/3 dài 2156 bp. Điện di sản phẩm cắt trên agarose (hình 3.10) nhận được 3 băng DNA trong đó 2 băng có kích thước khoảng 1,8 và 2,2 kb tương ứng với kích thước tính
toán. Băng DNA trên cùng có kích thước khoảng 4 kb tương ứng với kích thước của pRTRA7/3-CrPrx. Băng có kích thước khoảng 1,8 kb được thôi gel và tinh sạch để thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx cho bước phát triển vector tiếp theo.
Hình 3.9: Kết quả cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx bằng HindIII thu nhận cấu trúc chứa gen CrPrx
M: thang chuẩn DNA 1 kb 1: sản phẩm cắt bởi HindIII 2: plasmid không cắt bởi HindIII
Cắt mở vòng vector pBI121
Vùng MCS của vector pBI121 có một điểm cắt của enzyme HindIII như vậy khi cắt mở vòng khi sản phẩm cắt tối ưu sẽ cho ra một băng vạch khoảng 12 kb. Điện di sản phẩm tinh sạch sau khi cắt mở vòng plasmid pBI121 trên gel
hợp với kích thước đã tính toán. Trên gel điện di xuất hiện một băng duy nhất, không có sản phẩm phụ hay trạng thái đứt gãy của DNA. Sản phẩm DNA được tinh sạch đảm bảo sử dụng tốt cho phát triển vector chuyển gen.
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid vector pBI121
A. Kết quả điện di sản phẩm plasmid cắt bằng HindIII (1) Plasmid pBI121 không xử lý bằng enzyme (đối chứng)
(2) Plasmid pBI121 sau khi xử lý bằng enzyme hindIII
B. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch vector pBI121 sau khi thôi gel M: Thang DNA 1kb chuẩn
1: Vector pBI121 tinh sạch
Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx
Ghép nối cấu trúc gen CrPrx (35S-CrPrx-Cmyc) vào pBI121 bằng cách sử dụng T4 ligase để gắn cấu trúc CaMV35S-CrPrx-Cmyc-KDEL-polyA vào plasmid pBI121 mở vòng. Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến E.coliDH5α bằng sốc nhiệt, sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin, nuôi ở 37o
C trong 16 giờ. Trên môi trường nuôi cấy sau 16 giờ ở 37oC xuất hiện nhiều khuẩn lạc, mỗi dòng khuẩn lạc này có thể mang một trong hai là plasmid tái tổ hợp
khuẩn lạc với cặp mồi Prx-NcoI/Prx-NotI để lựa chọn dòng khuẩn lạc mang vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx.
Hình 3.11: Kết quả điện di colony-PCR của vector tái tổ hợp pBI121-CrPrx
M: Thang DNA 1kb chuẩn
1-4: Các dòng khuẩn lạc pBI121-CrPrx
(+): Đối chứng dương, (-): Đối chứng âm
Kết quả colony-PCR (Hình 3.11) cho thấy, dòng khuẩn lạc 4 âm tính (không xuất hiện băng đặc hiệu) có thể do chứa plasmid pBI121 tự đóng vòng, kháng được kanamycin nhưng không mang cấu trúc gen CrPrx. Các dòng khuẩn lạc 1, 2, 3, dương tính với phản ứng colony-PCR (xuất hiện băng đặc hiệu khoảng 1 kb) có thể chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx. Những dòng khuẩn lạc dương tính này được nuôi trong LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc (kanamycin) để tách plsamid nhân dòng vector tái tổ hợp cho quá trình biến nạp vào A.tumefaciens phục vụ chuyển gen.
3.4. Tạo vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen CrPrx
Plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrPrx tách từ sinh khối vi khuẩn
E.coli DH5α được biến nạp vào A.tumefaciens EHA105 bằng kỹ thuật xung điện. Sản phẩm biến nạp sau khi nuôi phục hồi trong LB lỏng được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l và rifamycin 50mg/l nuôi ở 28oC trong 48 giờ. Sau đó, chọn 7 dòng khuẩn lạc
riêng rẽ mọc trên mặt thạch, tiến hành colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu
Prx-NcoI/Prx-NotI. Kết quả thu được ở hình 3.12.
Hình 3.12: Kết quả điện di sản phẩm A.tumefaciens mang vector chuyển gen M: Thang DNA 1kb chuẩn
1-7: các dòng khuẩn lạc A.tumefaciens EHA105 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen pBI121-CrPrx
(+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm
Sản phẩm điện di cho thấy, 7 dòng khuẩn đều dương tính, có cùng một kích thước 1 kb với giếng đối chứng dương. Giếng đối chứng âm không có băng xuất hiện. Chứng tỏ rằng 7 dòng A.tumefaciens đều mang vector chuyển gen CrPrx.
Các dòng dương tính được nuôi lỏng trong LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin và rifamycin để thu khối lượng lớn phục vụ chuyển gen.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Phân lập được đoạn gen CrPrx có chứa enzyme giới hạn NcoI/NotI. Gen
CrPrx phân lập từ cDNA vùng mã hóa gồm 993 nucleotide.
Thiết kế thành công vector chuyển gen mang cấu trúc CrPrx (35S-
CrPrx-Cmyc).
ĐỀ NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn, 2011. “Nghiên cứu tách chiết Alkaloid của rễ cây dừa cạn hoa hồng tại Bình Định”, Tạp chí KH&CN, Đại học Đà Nẵng, 2 (43), tr. 85 – 92.
2. Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh (1998), Bài giảng dược liệu, Tập 2, Nhà xuất bản Đại học Dược Hà Nội, tr. 5-24.
3. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng, 2006, “Ảnh hường của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển Khoa học & Công nghệ, ĐHQG HCM, tập 9, số 6, tr. 59 – 66.
4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
5. Viện dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1, Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
6. Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R. (1992), “Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua”, J Chem Ecol,
18:1955–1964.
7. Contin A., van der Heijden R., Lefeber A.W.M., Verpoorte R. (1998), “The iridoid glucoside secologanin is derived from the novel triose phosphate/pyruvate pathway in Catharanthus roseus cell culture”, FEBS Lett, 434: 413–416.
8. Costa MM, Hilliou F, Duarte P, Pereira LG, Almeida I, Leech M, Memelink J, Barceló AR, Sottomayor M (2008), “Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus”, Plant Physiol, 146(2): 403-17.
9. Fattorusso, E., Taglialatela, O., (2008). Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology. Wiley-VCH, Weinheim, Germany.
10. Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil- Izquierdo A., Pereira D.M., Valentao P., Andrade P.B., Duarte P., Barceló A.R., Sottomayor M. (2011), “Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair”, J Exp Bot, 62(8): 2841-2854.
11. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973), “Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng”, Chem Pharm Bull Tokyo, 21(1): 98-101.
12. Guggisberg, A., Hesse, M., . Alkaloids. The University of Zurich.
13. Javier Palazn, Rosa M Cusid, Jordi Gonzalo, Mercedes Bonfill, Carmen Morales, M Teresa Pinol (1998), “Relation Between the Amount of rolC Gene Product and Indole Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus
Transformed Root Cultures”, Journal of Plant Physiology, 153: 712.
14. Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu (2013), “Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation”, MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432.
15. Junaid Aslam, Abdul Mujib, Seikh A. Nasim, Maheshwar Prasad Sharma (2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L. (G) Don”, Scientia Horticulturae, 119(3): 325-329.
16. Kumar S, Dutta A, Sinha AK, Sen J. (2007), “Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus”,
17. Kumar S, Jaggi M, Taneja J, Sinha AK, (2011), “Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus”, Plant Physiol Biochem, 49 (4): 404-412.
18. Marfori E.C and Alejar (1993), “Alkaloid yeild variation in callus culture