3. Nội dung nghiên cứu
2.2.6. Kỹ thuật tách dòng gen
Tách dòng phân tử được thực hiện theo Sambrook và cộng sự (2001) [29]. Sản phẩm RT- PCR nhân gen CrPrx sau khi được làm sạch được gắn trực tiếp vào vector pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng gắn gen CrPrx vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
1 T4 DNA ligase buffer 10X 1,0
2 T4 DNA ligase 5 u/l 1,0
3 CrPrx 200 ng/l 5,0
4 pBT 100 ng/l 1,0
5 Nước khử ion - 2,0
Tổng thể tích 10,0
Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ là 22oC trong 3 giờ sau đó để trong tủ 4oC trong 15 - 20 phút. Biến nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.
Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α
Tế bào khả biến được lấy từ tủ -800C chuyển sang môi trường -40
C. Sau 30 phút biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.
Bổ sung 10µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến E.coli DH5α và trộn nhẹ. Hỗn hợp được để trong bình đá 10 phút, sau đó ủ ở 420
C (trong 1 phút 30 giây), rồi chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 300µl LB lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.
Bảng 2.4: Thành phần môi trường nuôi cấy khuẩn
Môi trường Thành phần
LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast Extract 5g/l, pH = 7 LB đặc LB lỏng + agar 16g/l
Cấy trải
Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi trường LB đặc (Tripton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung kháng sinh carbenicilin (50mg/l), IPTG (0,1mM) và X-gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 37oC trong 16 giờ.
Chọn dòng và kiểm tra sản phẩm chọn dòng
Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng dùng tăm tre khử trùng chấm những khuẩn lạc có khả năng mang plasmid tái tổ hợp chứa gen CrPrx, hoà ngay vào 10µl nước khử ion, dung dịch này dùng làm DNA khuôn cho phản ứng colony - PCR. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu CrPrx-NcoI/CrPrx-NotI. Thành phần phản ứng colony - PCR đươ ̣c thể hiê ̣n ở bảng 2.5.
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng colony - PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l) 1 PCR Masster Mix 2X 7,5 2 CrPrx-NcoI 10 pmol/l 0,5 3 CrPrx-NotI 10 pmol/l 0,5 4 DNA plasmid 200 ng/l 0,5 5 Nước khử ion - 6,0 Tổng thể tích 15,0
Chu trình nhiệt được đặt như sau: Biến tính khởi động ở 94o
C trong 4 phút; (biến tính ở 940C trong 30 giây; gắn mồi ở 58oC trong 30 giây; tổng hợp kéo dài ở 72oC trong 30 giây) x 35 chu kỳ; ổn định mẫu và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút; bảo quản mẫu ở 4o
C.
Kiểm tra sản phẩm cDNA trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng
Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung carbenicilin 50mg/l) nuôi ở 37oC trong khoảng 16 giờ.
Tách chiết plasmid
Tách chiết plasmid theo Sambrook và cs (2001) [28], tinh sạch bằng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen).
Bảng 2.6: Thành phần hoá chất tách plasmid
Ký hiệu Thành phần
Sol I Glucose 50mM; Tris HCl 25mM, pH= 8; ETDA 10mM, pH= 8 Sol II NaOH 0,2M; SDS 1%
Sol III 60ml CH3COOK 5M; 11,5ml CH3COOH; 28,5ml H2O
Các bước tiến hành:
Cấy chuyển một khuẩn lạc vào trong 5ml LB lỏng, nuôi qua đêm ở 37o C (16 giờ), 200v/p.
Hút 2ml dịch môi trường nuôi cấy vào ống Eppendorf 2ml. Ly tâm 7000v/p trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi thu cặn tế bào.
Hoà tủa tế bào bằng 100µl dung dịch Sol I bằng cách vortex. Sol I có tác dụng ổn định tế bào, hòa tan cặn.
Bổ sung 200µl dung dịch Sol II, đảo nhanh và nhẹ để tránh đứt gãy DNA. Sol II có SDS nên có tác dụng phá vỡ tế bào giải phóng DNA genome và DNA plasmid.
Bổ sung tiếp 150µl dung dịch Sol III để kết tủa protein, đảo nhanh và nhẹ, trong dung dịch sẽ thấy xuất hiện kết tủa trắng. Đây là bước trung hoà, toàn bộ protein và DNA genome (vì có kích thước lớn) sẽ bị kết tủa còn DNA plasmid (vì có kích thước nhỏ) nên vẫn hoà tan trong dung dịch.
Thêm vào ống 450µl cloroform : isoamyl (24:1), lắc nhẹ, mục đích để hoà tan các protein có kích thước nhỏ. Ly tâm ở 12000v/p trong 15 phút, mẫu phân thành 3 pha: pha trên là DNA plasmid, pha giữa là protein kích thước lớn không tan (kết tủa trắng), pha cuối là chlorofom chứa protein tạp.
Dùng pipet hút dịch trong ở pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5ml mới. Sau đó bổ sung isopropanol tỷ lệ 1:1 (isopropanol sẽ làm kết tủa DNA plasmid). Để ở -20oC trong 30 phút. Sau đó ly tâm 12000v/p trong 10 phút, bỏ dịch.
Rửa tủa bằng 500µl cồn ethanol 70%. Ly tâm 12000v/p trong 5 phút, thu tủa. Tủa được làm khô trong box cấy vô trùng. Sau đó thêm 45µl H2O. Ủ hỗn hợp ở 37°C trong 15 phút để làm tan tủa.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.7. Phƣơng pháp xác định và phân tích trình tự nucleotide đoạn gen CrPrx
Các plasmid tái tổ hợp mang gen CrPrx được xác định trình tự trên trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Các trình tự được xử lý bằng các phần mềm BLAST/NCBI, DNAstar và BioEdit. So sánh trình tự gen CrPrx phân lập từ cây dừa cạn của Việt Nam và trên thế giới đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế.
2.2.8. Thiết kế vector chuyển gen mang CrPrx
Vector chuyển gen CrPrx được thực hiện gồm các bước cơ bản: (1) phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrPrx; (2) gắn cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen ở thực vật pBI121.
Phát triển cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrPrx bao gồm cắt đồng thời vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3 bằng enzyme giới hạn NcoI/NotI.
Bảng 2.7: Thành phần cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx và pRTRA7/3
STT Thành phần Nồng độ Thể tích(μl) 1 Tango Buffer 10X 6 2 NcoI 10 u/μl 2 3 NotI 10 u/μl 2,5 4 Plasmid pBT 200 ng/μl 13 5 Nước khử ion - 6,5 Tổng 30
Điều kiện phản ứng 37oC trong 5 giờ
Lấy mẫu cất vào tủ 4oC để dừng phản ứng trong 10 phút. Tiếp theo điện di và thôi gel dựa vào kích thước của gen và vector sau đó tinh sạch và kiểm tra.
Ghép nối gen CrPrx vào vector pRTRA7/3 gồm các thành phần như sau:
Bảng 2.8: Thành phần ghép nối vector pRTRA7/3 và gen CrPrx
STT Thành phần Nồng độ Thể tích(l) 1 Nước khử ion - 7 2 T4 ligase Buffer 10X 2 3 T4 ligase 5 u/μl 1 4 Gen CrPrx 100 ng/μl 5 5 pRTRA7/3 200 ng/μl 5 Tổng 20
Điều kiện phản ứng: 22oC trong 3 giờ
Vector tái tổ hợp pRTRA7/3 mang gen chuyển CrPrx được biến nạp vào E.coli DH5α với mục đích nhân dòng pRTRA7/3-CrPrx.
Gắn cấu trúc gen CrPrx vào vector chuyển gen ở thực vật pBI121
Dựa vào vị trí các điểm cắt trên vector tái tổ hợp chúng tôi cắt đồng thời pRTRA7/3-CrPrx và pBI121 bằng HindIII.
Dựa vào kích thước các phân đoạn DNA, lựa chọn và tinh sạch các băng điện di theo chỉ dẫn của kít GeneJET PCR Purification để thu nhận các thành phần cần cho phát triển vector.
Bảng 2.9: Thành phần phản ứng cắt plasmid pRTRA7/3-CrPrx và pBI121
STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l)
1 H2O - 10
2 R Buffer 10X 3
3 HindIII 5 u/μl 2
4 Plasmid 200 ng/μl 15
Tổng 30
Điều kiện phản ứng: 37oC trong 5 giờ
Ghép nối cấu trúc gen CrPrx và pBI121 đã mở vòng mục đích tạo vector chuyển gen ở thực vật pBI121 mang cấu trúc gen CrPrx. Vector chuyển gen pBI121-CrPrx được biến nạp vào E.coli DH5α nhằm nhân được dòng mang cấu trúc này. Chọn lọc dòng khuẩn bằng phương pháp colony - PCR.
Biến nạp cấu trúc mang gen CrPrx vào A. tumerfaciens
Biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào A. tumefaciens bằng phương pháp xung điê ̣n :
Rửa cuvette xung điện bằng cồn 100o
C, rửa lại bằng nước khử ion rồi thấm khô, khử trùng bằng tia UV.
Tế bào khả biến A. tumefaciens chủng EHA105 lấy từ tủ -84oC đặt vào trong đá 30 phút, bổ sung 1μl vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và đảo nhẹ.
Chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vào cuvette.
Xung điện: 2,5kv, 25µF và điện trở 400, đặt vào đá. Sau 5 phút bổ sung 500μl LB lỏng và trộn nhẹ.
Sau đó, chuyển tất cả hỗn hợp dịch A. tumefaciens + vector tái tổ hợp vừa được xung điện từ cuvette vào ống eppendorft 2ml, ủ ở 280c trong 2 giờ trong tủ lắc.
Sử dụng que cấy trải đã khử trùng cấy trải 300µl vào các đĩa chọn lọc chứa kháng sinh kanamycine 50mg/l và rifamycin 50mg/l. Ủ ở 280
c từ 24 - 48 giờ. Kiểm tra bằng phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu.
2.2.9. Xử lý số liệu bằng phần mềm chuyên dụng
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và tách dòng gen CrPrx
3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen CrPrx từ mRNA
Dựa trên trình tự Prx đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số LN809932, cặp mồi đặc hiệu Prx-NcoI/Prx-NotI có điểm cắt của enzyme giới hạn được thiết kế để nhân gen CrPrx. Đoạn gen CrPrx nhân bằng cặp mồi đặc hiệu có kích thước dự tính 1 kb.
RNA tổng số đươ ̣c tách chiết từ mẫu lá của cây dừa cạn được sử dụng làm khuôn cho phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA với cặp mồi oligoT (Random Hexamer Primer). Sản phẩm thu được dùng làm nguyên liệu cho phản ứng RT- PCR.
Phản ứng PCR nhân đoạn mã hóa của gen CrPrx bằng cặp mồi đặc hiệu
CrPrx-NcoI/CrPrx-NotI. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra cùng marker 1 kb trên gel agarose 1% thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại đoạn
cDNA CrPrx
M: Thang DNA 1kb chuẩn 1 - 3: Sản phẩm PCR gen CrPrx
Để tách dòng được gen này, chúng tôi tiến hành ghép nối sản phẩm PCR tinh sạch vào vector tách dòng pBT đã cắt mở vòng. Sau đó, biến nạp vào chủng E. coli DH5α.
3.1.2. Kết quả ghép nối gen CrPrx vào vector tách dòng
Quá trình ghép nối vector pBT và CrPrx được thực hiện dưới sự xúc tác của của T4 ligase và dung dịch đệm tương ứng. T4 ligase có nguồn gốc từ tế bào E. coli nhiễm phage T4, có khả năng ghép nối hai trình tự DNA đầu so le và đặc biệt là hai trình tự đầu bằng. Enzyme này được sử dụng phổ biến trong thí nghiệm dùng để ghép nối do có khả năng hình thành liên kết phosphodiester giữa các nucleotide đứng cạnh nhau. Phản ứng ghép nối được thực hiện ở 22°C trong 3 giờ để tổ hợp pBT- CrPrx được tạo thành với hiệu suất cao nhất.
Ghép nối gen CrPrx vào pBT có thể xảy ra các trường hợp: (1) gen
CrPrx tự gắn lại với nhau; (2) vector tự đóng vòng; (3) gen CrPrx gắn với vector pBT. Trong đó, phần lớn là trường hợp sản phẩm PCR gắn với vector vì trong kỹ thuật PCR để nhân gen, chúng tôi đã sử dụng Taq – polymerase với hoạt tính gắn thêm Adenine vào đầu 3’của sản phẩm PCR, mặt khác trên vector pBT đã sẵn có hai đầu dính là Thymine ở đầu 5’ của mỗi sợi. Vì vậy, khi được lai ghép với nhau, sản phẩm PCR có đầu dính Adenine dễ dàng nối với vector có đầu dính Thymine theo nguyên tắc bổ sung. Tuy nhiên, trên thực tế vẫn có một tỷ lệ nhất định vector tự đóng vòng do đứt gãy đầu Thymine trong quá trình thao tác và một số gen tự lai ghép với nhau.
3.1.2.1.Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coliDH5α Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR đã tinh sạch vào vector tách dòng pBT.
Vector tái tổ hợp pBT-CrPrx được biến nạp vào tế bào vi khuẩn khả biến
của CaCl2 thành tế bào vi khuẩn đang ở thời kỳ sinh trưởng sẽ trở lên mỏng đi, xốp hơn và phồng lên tạo điều kiện thuận lợi cho DNA có thể chui qua các lỗ màng tế bào vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Sau khi sốc nhiệt, bổ sung LB lỏng và nuôi lắc ở 37oC trong 1 giờ. Sản phẩm biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG. Cơ chất X-gal giúp cho việc chọn lọc các dòng tế bào E. coli mang vector tái tổ hợp dễ dàng hơn. Trên môi trường có kháng sinh chọn lọc carbenicillin, X-gal và IPTG phát triển hai loại khuẩn lạc là khuẩn lạc màu xanh và màu trắng.
Hình 3.2: Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E. coli DH5 chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx
Kết quả trải đĩa ở hình 3.2 cho thấy, có rất nhiều khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, có kích thước tương đối đồng đều.
Tất cả các khuẩn lạc này là những khuẩn lạc đã được biến nạp plasmid chứa gen kháng sinh chọn lọc carbenicillin. Nhưng chỉ có khuẩn lạc màu trắng mới mang plasmid tái tổ hợp. Vì vậy, các khuẩn lạc màu trắng được lựa chọn để thực hiện các bước tiếp theo của quá trình tách dòng. Nhưng ở hình 3.2, chỉ có khuẩn lạc trắng điều đó nói lên rằng, quá trình biến nạp rất thành công. Tất cả, các khuẩn lạc có thể đều mang plasmid tái tổ hợp.
3.1.2.2.Kết quả kiểm tra vector tái tổ hợp bằng colony-PCR
Để kiểm tra chính xác các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen
CrPrx quan tâm, chúng tôi tiến hành sàng lọc khuẩn lạc bằng kĩ thuật colony- PCR. Chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến
E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen CrPrx. kiểm tra khuẩn lạc bằng phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu Prx-NotI/Prx-NcoI. Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Nếu khuẩn có plasmid mang gen CrPrx thì sản phẩm PCR sẽ xuất hiện băng có kích thước mong muốn khoảng gần 1 kb.
Hình 3.3: Kết quả điê ̣n di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc M: Thang DNA 1kb chuẩn
1 - 6: Các dòng khuẩn lạc
Hình ảnh điện di ở hình 3.3 cho thấy, trong 6 dòng khuẩn lạc trắng kiểm tra có 4 dòng cho kết quả dương tính với PCR, ngoại trừ dòng thứ 2 và 5 cho kết quả âm tính. Từ kết quả colony- PCR, chúng tôi lựa cho ̣n 4 dòng khuẩn lạc (1, 3, 4, 6) đem nuôi trong 5ml LB lỏng có bổ sung carbenicillin ở 37oC trong 16 giờ. Dùng tách plasmid phục vụ cho việc xác định trình tự gen.
3.1.2.3. Kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa CrPrx trong vector tách dòng pBT bằng enzyme cắt giới hạn
Để kết luận chính xác plasmid có chứa gen mã hóa CrPrx hay không, chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên một dòng DNA plasmid, dùng để cắt bằng enzyme cắt giới hạn. Vector pBT có thể cắt bằng các cặp enzyme khác nhau. Nhưng do gen CrPrx sử dụng cặp mồi có điểm cắt của enzyme giới hạn
NcoI/NotI, nên vector pBT-CrPrx cần phải cắt bằng enzyme NcoI/NotI để gen không bị cắt thành nhiều đoạn. Ngoài ra, tạo đầu nối giữa 2 DNA khi ghép nối với vector trung gian tạo vector tái tổ hợp.
Mục đích của bước này là kiểm tra sự có mặt của gen CrPrx trong vector tác dòng pBT. Ngoài ra, còn mục đích cắt và thu nhân được gen CrPrx để tạo đầu dính tương ứng, thuận lợi cho việc gắn gen vào vector trung gian. Sản