Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

3. Nội dung nghiên cứu

1.3.1. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở

cây dừa cạn bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật

Marfori và Alejar (1993) đã nghiên cứu khả năng sản xuất alkaloid của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống cây dừa cạn trắng và hồng tím. Kết quả thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi trường LS bổ sung BA 3mg/l, 2,4-D 0.5mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được hình thành chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ [18].

Pietrosiuk và cs (1999) đã tạo được hai dòng mô sẹo cây dừa cạn trắng và xanh trên môi trường Gamborg rắn bổ sung kinetin 0,1mg/l và IAA 1mg/l. Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây cây dừa cạn. Dòng mô sẹo trắng đã được chọn từ những mô sẹo xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng cho thấy, các indole alkaloid tồn tại ở dạng vết và không có dược tính [26].

Bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), nghiên cứu của Junaid Aslam và cs (2009) cho thấy, có sự khác nhau về hàm lượng vincristine trong các loại mô sẹo (mô sẹo phôi và không phải mô sẹo phôi) thu được từ nuôi cấy

in vitro. Hàm lượng vincristine trong các giai đoạn của sự phát triển phôi (phôi chín, phôi nảy mầm), các bộ phận khác nhau của cây (lá, rễ…) trồng ngoài tự nhiên cũng có sự khác nhau. Nghiên cứu đã khẳng định, hàm lượng vincristine cao trong mô sẹo lá và phôi nảy mầm. Lá của cây nuôi cấy trong ống nghiệm có hàm lượng hàm lượng vincristine cao hơn lá của cây nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng ở giai đoạn tương tự [15]. Kết quả nghiên cứu này góp phần định

hướng sản xuất vincristine trong các loại mô và các giai đoạn cụ thể để đạt hiệu quả cao.

Zhao và cs (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào cây dừa cạn. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25mg/l, 32mg/l và 22mg/l trong bình lắc 500ml, 1000ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít. Tác giả cũng đã quan sát thấy, có sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ như: sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy cây dừa cạn và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường jasmonate [36].

Tarek Kapiel (2010) đã nghiên cứu các điều kiện để tối ưu hóa khả năng tổng hợp alkaloid trong tế bào cây dừa cạn nuôi cấy dịch huyền phù bằng cách bổ sung một số yếu tố kích thích vào môi trường MS. Môi trường cho sự sinh trưởng tối ưu của mô sẹo nhận được từ trụ dưới lá mầm và lá mầm là môi trường MS bổ sung 2,4D và BA đều với nồng độ 1mg/l (môi trường MS4). Trong khi đó môi trường tối ưu cho mô sẹo nhận được từ lá là MS, bổ sung NAA và BA cùng với nồng độ 1mg/l (môi trường MS6) [31]. Pan và cs (2010) trong nghiên cứu của mình cũng đã khẳng định, chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp vinblastine, vindoline và catharanthine của cây dừa cạn nuôi cấy [23].

Cùng hướng nghiên cứu trên, Jinwei Liu và cs (2013) nghiên cứu bổ sung artemisinic acid vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào cây dừa cạn và đã nhận thấy, sự tăng cường khả năng sản sinh terpenoid indole alkaloids ở tế bào nuôi cấy. Hàm lượng của vindoline và vinblastine thu được từ môi trường nuôi cấy có xử lý với artemisinic acid tăng sáu lần và gấp đôi tương ứng so với hàm lượng của 2 alkaloids này trong nhóm đối chứng. Nhóm tác giả đã nghiên cứu sự biểu hiện gen của 4 enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp

vinblastine trong môi trường nuôi cấy huyền phù cây dừa cạn. Bằng phương pháp RT-PCR cho thấy, artemisinic acid có thể điều chỉnh lên phiên mã của các gen tổng hợp decarboxylase tryptophan, geraniol 10-hydroxylase, tabersonine 16-hydroxylase và deacetoxyvindoline 4-hydroxylase [14].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây dừa cạn bắt đầu được công bố vào năm 2006 với công trình của Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng. Nghiên cứu của các tác giả cho thấy, mô sẹo xanh được cảm ứng từ lá dừa cạn nuôi cấy in vitro

trong môi trường MS lỏng, bổ sung NAA1mg/l + kinetin 0,5mg/l cho sinh khối và hàm lượng alkaloid cao nhất. Hàm lượng đường sucrose 60g/l cho kết quả nuôi cấy tốt nhất. Kết hợp giữa NAA 1mg/l + kinetin 0,5mg/l + sucrose 60g/l đã thu nhận được hàm lượng vincristine từ mô nuôi cấy cao hơn lá cây dừa cạn ngoài tự nhiên [3]. Bằng phương pháp sắc khí lỏng cao áp – khối nhỏ liên hợp (LC-MS), Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011) đã xác định được 2 alkaloid quan trọng là vinblastine và vincristine từ rễ cây dừa cạn hoa hồng đạt 65,84% so với hàm lượng alkaloid tổng số [1].

1.3.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phƣơng pháp chuyển gen cây dừa cạn bằng phƣơng pháp chuyển gen

Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật. Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen rolA, rolB, rolC và rolD. Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ. Vì vậy, nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập.

Javier và cs (1998) thu được các dòng rễ cây dừa cạn chuyển gen phát triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5 1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng indole alkaloid trong rễ nuôi cấy đã được xác định. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine. Trong điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất. Như vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất alkaloid cao. Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [13].

Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây dừa cạn bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến nạp vector nhị thể pCAMBIA2301 chứa gen β-glucuronidase (GUS) và gen neomycin phosphotransferase II (NTPII). Lây nhiễm A.tumefaciens chủng EHA tái tổ hợp nói trên vào mô sẹo, chồi và rễ, sau đó chuyển các mẫu lên môi trường nuôi cấy bổ sung kanamycin, các tác giả đã thu được các dòng cây tái sinh. Biểu hiện của gen GUS được xác định thông qua biểu hiện kiểu hình của mô nuôi cấy trên môi trường bổ sung X-gal. Sự có mặt của gen GUS được xác định bằng phản ứng dây chuyền polymerase và phân tích southern blot. Để chứng minh hiệu quả của kĩ thuật chuyển gen thông qua gen chỉ thị GUS vào cây dừa cạn, gen DAT mã hóa deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase đã được chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây To chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11%. Kết quả phân tích bằng HPLC cho thấy, có sự tăng hàm lượng của vindoline trong cây chuyển gen. Đây là báo cáo đầu tiên tính đến thời điểm công bố chuyển gen qua A. tumefaciens ở cây dừa cạn. Quan trọng hơn, việc chuyển thành công gen DAT vào cây dừa cạn sử đã khẳng định kĩ thuật chuyển gen cây dừa cạn được phát triển hoàn thiện, nâng cao tích lũy vindoline trong cây chuyển gen [35].

Các nghiên cứu chuyển gen ở cây dừa cạn hiện nay trên thế giới mới chỉ công bố thành công ở mức độ mô nuôi cấy và cây trong phòng thí nghiệm. Song các kết quả nghiên cứu này đã khẳng định tính khả thi của hướng nghiên cứu tạo cây dừa cạn chuyển gen nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine phục vụ điều chế thuốc chữa trị ung thư hiệu quả.

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1. Vật liệu

Hạt của cây dừa cạn hoa hồng tím do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, tỉnh Thái Nguyên cung cấp.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất

Sử dụng các hoá chất: EDTA, SDS, tris - HCl, X-gal, agar, cồn tuyệt đối, Bacto pepton, yeast extract, NaCl, agarose, sucrose, glucose, trypton, glycerol, ethanol 70%, nước k hử io n. Các loại kháng sinh kanamycin, rifamicine, carbecillin và các hóa chất thông dụng khác (X-gal, agarose,...).

Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR Accuprep PCR Purification (Bioneer - Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM

Plasmid Mini Extraction Kit”, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp.

2.1.2.2. Thiết bị

Cân điện tử Santorius ( Đức), tủ lạnh sâu, box cấy, nồi khử trùng Tomy (Nhật Bản), bộ điện di DNA của Bio - Rad

Máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy ly tâm, máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ) và một số thiết bị khác tại Phòng công nghệ DNA ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học

2.1.2.3. Chủng vi khuẩn và nguyên liệu DNA

Vector pTRA7/3, vector pBI121, vector tách dòng pBT, các chủng khuẩn E. coliDH5α và A. tumefaciens EHA1 0 5 mang gen GUS do Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học - cung cấp.

Hình 2.1: Vector tách dòng pBT

Hình 2.2: Vector pRTRA7/3

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

(A) Phân lập gen CrPrx từ mRNA và tách dòng gen CrPrx trong vector tách dòng pBT; (B) Cắt vector tái tổ hợp pBT-CrPrx, thu nhận gen CrPrx; (C) Cắt mở vòng vector pRTRA7/3; (D) Gắn gen CrPrx vào vector pRTRA7/3 tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx; (E) Cắt mở vòng vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrPrx, thu nhận cấu trúc gen CrPrx-Cmyc và mở vòng vector pBI121; (F) Ghép nối cấu trúc CrPrx-Cmyc vào vector pBI121 tạo vector chuyển gen chứa cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc; (G) Biến nạp pBI121-CrPrx vào A.tumefaciens E HA1 0 5 và c họ n dò n g A.tumefaciens E HA1 0 5 tá i tổ hợp mang cấu trúc 35S-CrPrx-Cmyc bằng colony-PCR.

Các phƣơng pháp sinh học phân tử 2.2.1. Thiết kế cặp mồi nhân gen

Cặp mồi được thiết kế với mục đích nhân gen CrPrx. Các bước thao tác: i) thu thập trình tự nucleotide từ ngân hàng gen NCBI; ii) thiết kế cặp mồi; iii) Kiểm tra chất lượng cặp mồi bằng phản ứng PCR.

Dựa trên trình tự Prx đã công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế có mã số LN809932. Chúng tôi tiến hành thiết kế cặp mồi nhân gen CrPrx trong cây dừa cạn hoa hồng tím, trên cặp mồi có gắn điểm cắt của enzyme giới hạn.

Cặp mồi đặc hiệu nhân gen CrPrx có điểm cắt của enzyme giới hạn

NcoI/NotI có trình tự là:

Prx-NcoI: 5’ – CATGCCATGGTAGGCTTCCAAAACTCTCTTCT – 3’

Prx-NotI: 5’ – ATTTGCGGCCATGTAACTTATTAGCTACATTA – 3’ Trong đó: CCATGG là vị trí cắt của enzyme NcoI

GCGGCC là vị trí cắt của enzyme NotI

Đoạn gen CrPrx được nhân lên bằng cặp mồi có chứa enzyme giới hạn có kích thước dự tính 1 kb, tương ứng với kích thước gen đã công bố tại Ngân hàng Gen quốc tế mang mã số LN809932.

2.2.2. Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số

Chuẩn bị mẫu: (1) Thu mẫu và xử lí mẫu: Quả sau khi thu về được phơi khô 2 – 3 ngày, sau đó tách ra lấy hạt. Cho hạt vào ống falcon 50ml lắc nhiều lần để rửa sạch hạt trước khi tiến hành vào mẫu. (2) Khử trùng hạt: Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, javen 60% lắc đều trong 15 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS cơ bản, bổ sung thêm sucrose 30g/l và agar 8g/l. Sau khi hạt nảy mầm được 2 đến 3 lá trên cây mang đi tách chiết RNA tổng số.

Tách RNA tổng số được thực hiện theo theo các bước như sau: Nghiền nhanh 100mg mẫu trong nitơ lỏng thành bột mịn. Thêm 1ml Trizol Regents, đảo nhẹ 5 phút.

Bổ sung 200µl cloroform : isoamyl (24:1), đảo đều 5 phút.

Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu 500µl dịch nổi cho vào ống eppendort 1,5ml.

Bổ sung 500µl isopropanol để ở 4oC vào ống, đảo đều 15 phút ở 25oC, để ở tủ -20oC trong vòng 30 phút. Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 4o

C, thu tủa, làm khô tủa.

Thêm 500µl cồn 70% (cồn pha trong DEPC), ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa. Bước này lặp lại hai lần.

Làm khô RNA bằng mở nắp ống eppendort trong box vô trùng. Bổ sung 50µl H2O, ủ ở nhiệt độ 55oC trong 15 phút cho tan RNA.

Bảo quản trong tủ -20o C

2.2.3. Phƣơng pháp tổng hợp cDNA từ mRNA

Phương pháp tổng hợp cDNA: Làm tan, li tâm nhanh các thành phần của kit, giữ trên đá.

Cho vào ống vô trùng có thể tích 0,5ml các thành phần sau: H2O (DEPC) 5μl

Mồi oligoT (15μg/μl) 1 μl RNA khuôn (100ng/μl) 6 μl

Đảo nhẹ, ủ 65oC trong 5 phút sau đó lấy ra chuyển ngay vào đá lạnh trong 5 phút.

Bổ sung vào ống thêm các thành phần sau:

5X Reaction Buffer (5X) 4 μl Ribolock Rnase Inhibitor (40u/μl) 1 μl dNTPs (10mM) 2 μl RrevertAid H Minus Transcriptase (200u/μl) 1 μl Tiến hành li tâm nhanh, chuyển mẫu sang ủ trong máy PCR theo chu trình nhiệt: 25oC trong 5 phút; 42oC trong 60 phút; kết thúc phản ứng ở 70o

C trong 5 phút.

2.2.4. Nhân gen CrPrx bằng kĩ thuật RT-PCR

Phản ứng RT- PCR được tiến hành với thành phần phản ứng đươ ̣c trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen CrPrx STT Thành phần Nồng độ Thể tích (l) 1 PCR Masster Mix 2X 12,5 2 CrPrx-NcoI 10 pmol/l 1,0 3 CrPrx-NotI 10 pmol/l 1,0 4 cDNA 200 ng/ l 2,0 5 Nước khử ion - 8,5 Tổng thể tích 25,0

Chu trình nhiệt và thời gian của phản ứng nhân gen CrPrx đươ ̣c trình bày ở bảng 2.2:

Bảng 2.2: Chu trình nhiệt và thời gian phản ứng RT- PCR nhân gen CrPrx

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (o

C) Thời gian Chu kỳ

1 Biến tính khởi động 94 4 phút 1

2 Biến tính 94 30 giây

30

3 Gắn mồi 58 30 giây

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Kiểm tra sản phẩm cDNA trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

2.2.5. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR

Sau khi nhân được gen CrPrx với số lượng lớn, bước tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch.

Đây là phương pháp thu đoạn DNA tinh khiết dựa trên nguyên lý sử dụng cột có chứa hạt sepharose để giữ các phân tử DNA sợi kép đã được gắn với các hạt ion trong đệm gắn. “GeneJET Gel extraction Kit” của hãng Thermo scientific là bộ kít tinh sạch DNA được sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Bộ kít gồm các thành phần chính là đệm gắn DNA (binding buffer), cột thu nhận DNA, đệm rửa (wash buffer). Khi hỗn hợp DNA đi qua cột, các phân tử DNA sẽ gắn vào mạng lưới còn các thành phần khác như protein, muối…sẽ bị rửa trôi. Sau đó, để tách DNA ra khỏi cột người ta sử dụng một loại đệm có độ ion hóa thấp, đó là đệm thôi mẫu (elution buffer).

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification