3. Nội dung nghiên cứu
1.3.2. Sản xuất chế phẩm protease
1.3.2.1. Một số nghiên cứu sản xuất chế phẩm protease ở Việt Nam
Đồng Thị Thanh Thu (2004) đã nghiên cứu để sản xuất các chế phẩm enzyme protease từ vi sinh vật để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm. Tác giả đã tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease cao, đã xác định được hoạt tính protease và ứng dụng sản xuất chế phẩm protease [9].
Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006) đã khảo sát được một số tính chất của chế phẩm protease từ canh trường nuôi cấy bề mặt Aspergillus
oryzae và ứng dụng enzyme đó trong sản xuất nước mắm. Tác giả đưa ra các thông số động học của chế phẩm protease từ canh trường A. oryzae gồm Km=634.5mg/L và Vmax=13.98mg/L.min. Kết quả thực nghiệm cho thấy ion Na+, Zn2+ và Fe3+ đều là những tác nhân ức chế hoạt tính enzyme. Ngược lại, ion Mg2+ là tác nhân hoạt hóa. Đồng thời, tác giả ứng dụng chế phẩm protease trong sản xuất nước mắm nhằm rút ngắn thời gian thủy phân protein [3].
Đỗ Thị Bích Thủy (2012) đã nghiên cứu được các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1. Tác giả đã đưa ra một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của chủng B. amyloliquefaciens N1, phân lập từ nem chua Huế, như thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, pH ban đầu và thời gian lên men đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy rằng tinh bột hòa tan là nguồn carbon bổ sung vào môi trường cơ bản, có chứa 1% petone, 0,3% cao thịt và 0,5% NaCl, làm cho quá trình thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của B. amyloliquefaciens N1 tốt nhất; hoạt độ protease trong môi trường nuôi cấy đạt được 0,758 HP/ml. Nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens N1 trong môi trường thích hợp hoạt độ protease đạt cao nhất ở pH ban đầu bằng 8 và nhiệt độ 35oC. Thời gian thu nhận enzyme thích hợp nhất khi nuôi cấy chủng này trong các điều kiện trên là 32 giờ với hoạt độ đạt được là 0,777 HP/ml [10].
Bùi Thị Nhung (2013) xác định được một số điều kiện lên men sản xuất protease, nghiên cứu một số đặc tính của protease đã tinh sạch sơ bộ và đề xuất quy trình tạo chế phẩm protease giàu nattokinase dạng bột khô từ Bacillus subtilis có trong Natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng. Tác giả đã phân lập được các mẫu B. subtilis từ Natto của Nhật Bản, chọn lọc được khả năng sản xuất protease của một số mẫu phân lập, xác định được một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của mẫu chọn lọc, xác định một số điều kiện lên men sản xuất protease của chủng chọn lọc [5].
1.3.2.2. Quy trình sản xuất chế phẩm protease
Dịch chiết thô hay dịch nuôi cấy chứa enzyme sau khi đã loại bỏ tế bào và mảnh vụn tế bào được chuyển sang tinh sạch enzyme theo nhiều bước nhằm loại bỏ tất cả những chất ô nhiễm ảnh hưởng không tốt đến mục đích sử dụng. Tinh sạch cũng có thể phục vụ cho mục đích làm tăng hoạt tính đặc hiệu của chất xúc tác sinh học trong trường hợp cố định enzyme [1].
Protease ở A. oryzae là enzyme ngoại bào, dịch cô đặc enzyme chỉ chứa một số protein ngoại bào và các chất hoà tan có khối lượng phân tử thấp, vì màng tế bào làm hàng rào ngăn cản hầu hết thành phần của tê bào thoát ra ngoài, giúp cho việc tinh sạch enzyme có hiệu quả hơn. Trong thực tế, nhiều enzyme thuỷ phân được bán trên thị trường là các chế phẩm enzyme khá thô, không qua bước tinh chế nào [1].
Tinh sạch enzyme cơ bản dựa trên việc loại bỏ protein nhiễm bẩn bằng cách phân đoạn dựa trên khối lượng phân tử của enzyme thông qua phương pháp lọc gel, đây là bước trung gian giữa tinh chế và thu hồi enzyme. Mỗi bước tinh sạch làm tăng độ tinh sạch (thường được biểu thị trong thuật ngữ hoạt tính đặc hiệu: đơn vị hoạt tính trên đơn vị khối lượng protein) nhưng chắc chắn một sô enzyme hoạt tính bị mất dẫn đến hiệu suất thu hồi thấp hơn 100% [1].
Enzyme được tinh sạch đến mức độ cần, chế phẩm phải được lập công thức theo mục đích sử dụng. Việc lập công thức chế phẩm enzyme cũng giống như là một nghệ thuật và được các nhà sản xuất giữ bí mật chi tiết, hoặc không tiết lộ đối với khách hàng. Mặc dù không quan tâm nhiều đến giai đoạn sản xuất này trong các tài liệu tham khảo đã công bố, nhưng lập công thức là một bước quyết định trong sản xuất enzyme đặc biệt trong enzyme công nghiệp. Lập công thức enzyme bao gồm các bước thực hiện hoàn thiện cuối cùng, độ bển và tiêu chuẩn hoá chế phẩm enzyme. Bước hoàn thiện cuốì cùng nhằm hạn chế các chất nhiễm bẩn chưa loại bỏ trước đó [1].
Đối với trường hợp sản xuất nhỏ các enzym đặc biệt để ứng dụng trong y học, bước hoàn thiện bao gồm một số bước có tính chất chìa khoá để loại bỏ các chất nhiễm bẩn vết như pyrogen, nội độc tố, axit nucleic và virus. Đối với trường hợp enzym công nghiệp lớn, bước hoàn thiện cuối cùng là làm khô nếu sản xuất là chế phẩm rắn. Chế phẩm rắn có ưu thế dễ mang vác, vận chuyển và đời sống của nó tương đối cao, tuy nhiên, vấn đề hình thành bụi trong phân xưởng sản xuất là một vấn đề nghiêm trọng, do vậy nhiễm bẩn cần thiết giảm rủi ro dị ứng đối với công nhân làm việc [1].
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng giống
Chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 được cung cấp bởi Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy: môi trường PDA để giữ giống, môi trường cơ chất tổng hợp để tối ưu sản xuất protease.
Chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187 được nuôi cấy trong môi trường PDA để nhân và giữ giống gồm: glucose: 20g/l; khoai tây: dịch chiết 200g pha trong 1 lít môi trường; agar: 15-20g/l; pH = 7, khử trùng ở 121C trong 30 phút.
Dung dịch khoáng Czapek: 0,1% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05% (w/v) KCl; 0,01% FeSO4 (w/v); pH= 7, khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
Môi trường cơ chất tổng hợp để tối ưu sản xuất protease: bột lõi ngô; cám gạo; bột đậu tương; khoáng Czapek.
2.1.3. Hóa chất
Bảng 2.1. Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất Hãng sản xuất (nước)
Tyrosine Merck KGaA (Đức)
Cazein Fisher chemiscals (Đức)
Tween-80 BioBasic Inc (Mỹ)
Na2HPO4 Xilongchemical (Trung Quốc)
NaH2PO4 Xilongchemical (Trung Quốc)
Tricloaxetic (TCA) Xilongchemical (Trung Quốc)
Foling Merck KGaA (Đức)
HCl Xilongchemical (Trung Quốc)
NaOH Xilongchemical (Trung Quốc)
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm được liệt kê trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Hãng sản xuất (nước)
Box cấy vi sinh Naira (Mỹ)
Cân phân tích CPA224S Sartorius (Đức)
Cân kỹ thuật TE612 Sartorius (Đức)
Lò vi sóng Sharp (Malaysia)
Máy lắc Jeio tech (Hàn quốc)
Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)
Máy đo quang phổ UV Vis 2900 (Nhật Bản)
Nồi hấp tiệt trùng SA300VL Sturdy (Đài Loan) Tủ lạnh 4oC, -20oC, Sanaky (Việt Nam)
Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản)
Tủ ấm Memmert (Đức)
2.1.5. Dung dịch và đệm
Bảng 2.3. Danh sách các dung dịch và đệm được sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Dung dịch A Na2HPO4 0,1M; 3,5814g/100ml Dung dịch B NaH2PO4 0,1M; 1,38/100ml
Dung dịch đệm photphat gốc 50% dung dịch A, 50% dung dịch B Dung dịch Cazein 1g/100ml đệm photphat pha loãng 2 lần Dung dịch tricloaxetic 0,3M; 4,9g/100ml
Dung dịch Tyrosine chuẩn 181,12mg/5ml HCl 0,2N
Dung dịch Foling 0,5N; 25%foling 2N, 75% nước Dung dịch HCl 0,2N;1,614ml HCl đặc/100ml nước Dung dịch NaOH 1N; 4g/100ml
Dung dịch khoáng Cazpek
0,1% NaNO3; 0,1% K2HPO4; 0,05% MgSO4; 0,05% KCl; 0,01% FeSO4
2.2. Địa điểm và thời gian
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên.
Thời gian: Từ tháng 6/2017 đến 7/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp protease
Chủng nấm Aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease được nuôi cấy trong môi trường cơ chất tổng hợp gồm: 70% bột lõi ngô, 30% bột đậu tương, 6 ml khoáng Czapeck trong 10g cơ chất, lên men ở nhiệt độ 33C, sau 5 ngày.
2.3.2. Định tính protease trên đĩa thạch
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sau quá trình bảo quản đã được nhân hoạt hóa trên môi trường thạch thu bào tử và lên men trên môi trường cơ chất bột đậu tương/lõi ngô để đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease. Dịch chiết enzyme thô sau quá trình lên men được khảo sát định tính trên môi trường thạch đĩa 0,5% casein và 1,5% agar, sau 6-8 giờ để trong tủ lạnh 4C thì lấy ra cho vào tủ ấm. Sau 24 giờ ủ ở 30C, dùng thuốc thửCoomassie Brilliant Blue R250 (CBB) nhuộm lên bề mặt môi trường thạch đĩa để xác định vòng phân giải cơ chất.
2.3.3. Xác định hoạt độ protease
Hoạt độ protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến:
Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào sự thủy phân cơ chất casein bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng tricloacetic acid. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosine [4].
Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) được ủ ở 30oC trong 10 phút; ngưng phản ứng bằng dung dịch tricloacetic acid (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1 thể tích enzyme; ly tâm thu dịch nổi để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 660nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút ở 30oC có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong tricloacetic acid, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine [4].
Xây dựng đường chuẩn tyrosine: Pha dung dịch gốc tyrosine có nồng độ 10−3 (1 mM): cân 181,12mg tyrosine, hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N rồi định mức đến 100 ml bằng HCl 0,2N. Từ dung dịch gốc pha loãng thành dãy nồng độ dung dịch như sau:
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine
Tyrosine (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5 Nồng độ tyrosine (mol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30
Mỗi dung dịch trên lấy 1ml cho vào 7 ống nghiệm, cho thêm vào mỗi ống 5ml Na2CO3 0,5M và 1ml thuốc thử Folin, lắc đều. Mẫu đối chứng thay 1ml dung dịch tyrosine bằng 1ml nước cất. Giữ hỗn hợp phản ứng trong 20 phút, sau đó đo trên máy so màu ở bước sóng 750 nm. Lấy số liệu trung bình của hai ống nghiệm dựng đường chuẩn tyrosine với trục hoành là nồng độ tyrosine (e) tính theo mol/ml, trục tung là mật độ quang (OD) [4].
Đường chuẩn tyrosine được xây dựng như phần phương pháp đã nêu trên. Độ hấp phụ đo ở bước sóng 750nm. Sau đó tương quan giữa độ hấp phụ và nồng độ tyrosine được vẽ theo chương trình Excel (Hình 2.1). Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ 0,2 – 2µM.
Đường chuẩn có phương trình: y = 0,6475x + 0,0048. Trong đó: y – độ hấp phụ ở bước sóng 750nm; x- nồng độ Tyrosine trong dải 0,2-2µM; Đường chuẩn này được dùng để xác định hoạt tính protease trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine
Hoạt độ protease tính bằng đơn vị/gam hay đơn vị/ml theo công thức: Hdp = [[(ODTN – ODKT) - 0,0048].HSPL.V] / (0,6475.t.v.m) Trong đó:
OD – mật độ quang đo được của mẫu HSPL – Hệ số pha loãng (5 lần)
t – thời gian phản ứng (10 phút)
v – thể tích dịch enzyme phản ứng (2,5ml) m – Số gam cơ chất lên men (10g)
2.3.4. Tối ưu một số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease
Thí nghiệm được thiết kế độc lập đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187. Khi đánh giá yếu tố nào thì yếu tố đó biến thiên, các yếu tố khác được cố định.
2.3.4.1. Tối ưu tỉ lệ bột đậu tương và bột lõi ngô
Nguồn cơ chất hữu cơ gồm bột đậu tương và bột lõi ngô được sử dụng lên men để xác định ảnh hưởng nguồn cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease thích hợp nhất đối với chủng A. oryzae VTCC-F-0187.
Bột đậu tương được thay đổi tỉ lệ từ 45% giảm dần xuống đến 5%, bột lõi ngô được thay đổi theo với tỉ lệ từ 55% tăng dần đến 95%, đảm bảo mỗi mẫu thí nghiệm có tổng hai loại cơ chất là 100%.
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tỉ lệ bột đậu tương (%) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 tỉ lệ bột lõi ngô (%) 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Hỗn hợp hai loại cơ chất trên với tỉ lệ thay đổi được đưa vào mỗi bình tam giác 250ml với khối lượng 10g để lên men rắn, trong điều kiện độ ẩm ban đầu là 70%, nhiệt độ nuôi cấy là 33oC, pH 7. Sau 5 ngày tiến hành thu dịch enzyme để xác định hoạt tính.
2.3.4.2. Tối ưu nồng độ cám gạo bổ sung
Nguồn cơ chất gồm 35% bột đậu tương, bột lõi ngô thay đổi tỉ lệ từ 60% giảm dần đến 20% và bổ sung thêm bột cám gạo có tỉ lệ từ 5 % đến 45%, đảm bảo mỗi mẫu thí nghiệm có tổng 3 loại cơ chất là 100%.
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tỉ lệ bột đậu tương (%) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 Tỉ lệ bột lõi ngô (%) 60 55 50 45 40 35 30 25 20 Tỉ lệ cám gạo (%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Cân 10g hỗn hợp cơ chất với các tỉ lệ cơ chất khác nhau cho vào các bình tam giác 250ml để tiến hành lên men. Độ ẩm ban đầu ở các bình là 70%, nhiệt độ lên men là 33oC, pH 7, lên men trong 5 ngày sau đó thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease.
2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease
2.3.5.1. Tối ưu độ ẩm
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men trong ở các điều kiện độ ẩm khác nhau từ 50-90%. Cân 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo cho vào mỗi bình tam giác 250ml, nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 33oC, pH 7. Tiến hành thu dịch enzyme sau 5 ngày lên men để xác định hoạt tính.
2.3.5.2. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo với độ ẩm 60%, pH 7 trong thời
gian 5 ngày. Nhiệt độ nuôi cấy thay đổi từ 25-35°C. Dịch enzyme được thu sau 5 ngày dùng để xác định hoạt tính protease.
2.3.5.3. Tối ưu pH ban đầu
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men trong điều kiện thành phần môi trường tối ưu 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo với độ ẩm 60% và nhiệt độ thích hợp đã xác định, ở các điều kiện pH ban đầu của môi trường khác nhau từ 3,0-9,0.
2.3.5.4. Tối ưu thời gian sinh tổng hợp protease
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men ở 300C trong 10g môi trường cơ chất tổng hợp gồm: 55% bột lõi ngô, 35% bột đậu tương: 10% cám gạo, độ ẩm 60%, pH 7. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian lên men khác nhau từ 3-8 ngày (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính protease.
2.3.6. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm Microsotf excel