CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp protease
Chủng nấm Aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease được nuôi cấy trong môi trường cơ chất tổng hợp gồm: 70% bột lõi ngô, 30% bột đậu tương, 6 ml khoáng Czapeck trong 10g cơ chất, lên men ở nhiệt độ 33C, sau 5 ngày.
2.3.2. Định tính protease trên đĩa thạch
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sau quá trình bảo quản đã được nhân hoạt hóa trên môi trường thạch thu bào tử và lên men trên môi trường cơ chất bột đậu tương/lõi ngô để đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease. Dịch chiết enzyme thô sau quá trình lên men được khảo sát định tính trên môi trường thạch đĩa 0,5% casein và 1,5% agar, sau 6-8 giờ để trong tủ lạnh 4C thì lấy ra cho vào tủ ấm. Sau 24 giờ ủ ở 30C, dùng thuốc thửCoomassie Brilliant Blue R250 (CBB) nhuộm lên bề mặt môi trường thạch đĩa để xác định vòng phân giải cơ chất.
2.3.3. Xác định hoạt độ protease
Hoạt độ protease xác định theo phương pháp Anson cải tiến:
Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào sự thủy phân cơ chất casein bởi enzyme. Sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng tricloacetic acid. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, kết quả phân tích dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosine [4].
Hỗn hợp phản ứng thủy phân gồm dung dịch enzyme và dung dịch casein 2,0%, tỷ lệ 1:2 (v/v) được ủ ở 30oC trong 10 phút; ngưng phản ứng bằng dung dịch tricloacetic acid (TCA) 5,0% theo tỷ lệ 5 thể tích dung dịch acid cho 1 thể tích enzyme; ly tâm thu dịch nổi để thực hiện phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin 0,2N có mặt Na2CO3 6% (tỷ lệ dịch nổi: dung dịch Na2CO3: Folin 0,2N = 1:4:1). Thực hiện đồng thời mẫu kiểm tra bằng cách cho dung dịch TCA vào enzyme trước khi ủ với cơ chất. Độ hấp thụ ánh sáng (OD) của dung dịch màu thu được sau phản ứng được đo trên máy quang phổ ở bước sóng 660nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của enzyme. Một đơn vị hoạt độ protease được định nghĩa là lượng enzyme mà trong một phút ở 30oC có khả năng phân giải protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong tricloacetic acid, cho phản ứng màu tương đương với 1,0 µmol tyrosine [4].
Xây dựng đường chuẩn tyrosine: Pha dung dịch gốc tyrosine có nồng độ 10−3 (1 mM): cân 181,12mg tyrosine, hòa tan trong dung dịch HCl 0,2N rồi định mức đến 100 ml bằng HCl 0,2N. Từ dung dịch gốc pha loãng thành dãy nồng độ dung dịch như sau:
Bảng 2.4. Nồng độ pha loãng Tyrosine
Tyrosine (ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 HCl 0,2N (ml) 4,9 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,5 Nồng độ tyrosine (mol/ml) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 0,20 0,30
Mỗi dung dịch trên lấy 1ml cho vào 7 ống nghiệm, cho thêm vào mỗi ống 5ml Na2CO3 0,5M và 1ml thuốc thử Folin, lắc đều. Mẫu đối chứng thay 1ml dung dịch tyrosine bằng 1ml nước cất. Giữ hỗn hợp phản ứng trong 20 phút, sau đó đo trên máy so màu ở bước sóng 750 nm. Lấy số liệu trung bình của hai ống nghiệm dựng đường chuẩn tyrosine với trục hoành là nồng độ tyrosine (e) tính theo mol/ml, trục tung là mật độ quang (OD) [4].
Đường chuẩn tyrosine được xây dựng như phần phương pháp đã nêu trên. Độ hấp phụ đo ở bước sóng 750nm. Sau đó tương quan giữa độ hấp phụ và nồng độ tyrosine được vẽ theo chương trình Excel (Hình 2.1). Kết quả cho thấy, đường nồng độ chuẩn tuyến tính trong dải nồng độ 0,2 – 2µM.
Đường chuẩn có phương trình: y = 0,6475x + 0,0048. Trong đó: y – độ hấp phụ ở bước sóng 750nm; x- nồng độ Tyrosine trong dải 0,2-2µM; Đường chuẩn này được dùng để xác định hoạt tính protease trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 2.1. Đường chuẩn Tyrosine
Hoạt độ protease tính bằng đơn vị/gam hay đơn vị/ml theo công thức: Hdp = [[(ODTN – ODKT) - 0,0048].HSPL.V] / (0,6475.t.v.m) Trong đó:
OD – mật độ quang đo được của mẫu HSPL – Hệ số pha loãng (5 lần)
t – thời gian phản ứng (10 phút)
v – thể tích dịch enzyme phản ứng (2,5ml) m – Số gam cơ chất lên men (10g)
2.3.4. Tối ưu một số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease
Thí nghiệm được thiết kế độc lập đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm Aspergillus oryzae VTCC-F-0187. Khi đánh giá yếu tố nào thì yếu tố đó biến thiên, các yếu tố khác được cố định.
2.3.4.1. Tối ưu tỉ lệ bột đậu tương và bột lõi ngô
Nguồn cơ chất hữu cơ gồm bột đậu tương và bột lõi ngô được sử dụng lên men để xác định ảnh hưởng nguồn cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp protease thích hợp nhất đối với chủng A. oryzae VTCC-F-0187.
Bột đậu tương được thay đổi tỉ lệ từ 45% giảm dần xuống đến 5%, bột lõi ngô được thay đổi theo với tỉ lệ từ 55% tăng dần đến 95%, đảm bảo mỗi mẫu thí nghiệm có tổng hai loại cơ chất là 100%.
Bảng 2.5. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương và bột lõi ngô
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tỉ lệ bột đậu tương (%) 45 40 35 30 25 20 15 10 5 tỉ lệ bột lõi ngô (%) 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Hỗn hợp hai loại cơ chất trên với tỉ lệ thay đổi được đưa vào mỗi bình tam giác 250ml với khối lượng 10g để lên men rắn, trong điều kiện độ ẩm ban đầu là 70%, nhiệt độ nuôi cấy là 33oC, pH 7. Sau 5 ngày tiến hành thu dịch enzyme để xác định hoạt tính.
2.3.4.2. Tối ưu nồng độ cám gạo bổ sung
Nguồn cơ chất gồm 35% bột đậu tương, bột lõi ngô thay đổi tỉ lệ từ 60% giảm dần đến 20% và bổ sung thêm bột cám gạo có tỉ lệ từ 5 % đến 45%, đảm bảo mỗi mẫu thí nghiệm có tổng 3 loại cơ chất là 100%.
Bảng 2.6. Tỉ lệ tương ứng giữa bột đậu tương, bột lõi ngô và bột cám gạo
Mẫu thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tỉ lệ bột đậu tương (%) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 Tỉ lệ bột lõi ngô (%) 60 55 50 45 40 35 30 25 20 Tỉ lệ cám gạo (%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Cân 10g hỗn hợp cơ chất với các tỉ lệ cơ chất khác nhau cho vào các bình tam giác 250ml để tiến hành lên men. Độ ẩm ban đầu ở các bình là 70%, nhiệt độ lên men là 33oC, pH 7, lên men trong 5 ngày sau đó thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính protease.
2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease
2.3.5.1. Tối ưu độ ẩm
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men trong ở các điều kiện độ ẩm khác nhau từ 50-90%. Cân 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo cho vào mỗi bình tam giác 250ml, nuôi trong điều kiện nhiệt độ là 33oC, pH 7. Tiến hành thu dịch enzyme sau 5 ngày lên men để xác định hoạt tính.
2.3.5.2. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo với độ ẩm 60%, pH 7 trong thời
gian 5 ngày. Nhiệt độ nuôi cấy thay đổi từ 25-35°C. Dịch enzyme được thu sau 5 ngày dùng để xác định hoạt tính protease.
2.3.5.3. Tối ưu pH ban đầu
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men trong điều kiện thành phần môi trường tối ưu 10g cơ chất gồm 45% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo với độ ẩm 60% và nhiệt độ thích hợp đã xác định, ở các điều kiện pH ban đầu của môi trường khác nhau từ 3,0-9,0.
2.3.5.4. Tối ưu thời gian sinh tổng hợp protease
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được lên men ở 300C trong 10g môi trường cơ chất tổng hợp gồm: 55% bột lõi ngô, 35% bột đậu tương: 10% cám gạo, độ ẩm 60%, pH 7. Dịch enzyme được thu ở những khoảng thời gian lên men khác nhau từ 3-8 ngày (cách nhau 12 giờ) để xác định hoạt tính protease.
2.3.6. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm Microsotf excel 2013.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sau quá trình bảo quản đã được nhân hoạt hóa trên môi trường thạch thu bào tử và lên men trên môi trường cơ chất bột đậu tương/lõi ngô để đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease. Dịch chiết enzyme thô sau quá trình lên men được khảo sát định tính và định lượng hoạt tính protease. Dùng môi trường thạch đĩa 0,5% casein và 1,5% agar để thử hoạt tính. Các giếng thạch được cho lần lượt dung dịch đệm đối chứng, dung dịch enzyme với thể tích khác nhau 25-100 l và dung dịch enzyme đã xử lý nhiệt độ. Sau 6-8 giờ để trong tủ lạnh 4C thì lấy ra cho vào tủ ấm. Sau 24 giờ ủ ở 30C, dùng thuốc thử Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB)nhuộm lên bề mặt môi trường thạch đĩa để xác định vòng phân giải cơ chất.
Hình 3.1. Hoạt tính phân giải casein của dịch chiết enzyme ngoại bào từ cơ chất lên men xốp chủng A. oryzae VTCC-F-0187
1: thử đối chứng bằng 100 l đệm phosphate; 2: Thử hoạt tính với 25 l dịch enzyme; 3: Thử hoạt tính với 50 l dịch enzyme; 4: Thử hoạt tính với 75 l dịch enzyme; 5: Thử hoạt tính với 100 l dịch enzyme; 6: Thử hoạt tính với
100 l dịch enzyme đã đun sôi
Kết quả cho thấy, dịch chiết enzyme ngoại bào từ cơ chất lên men xốp chủng A. oryzae VTCC-F-0187 có hoạt tính phân hủy cơ chất casein mạnh với vòng phân giải cơ chất 20-25 mm khi thử với thể tích dịch từ 25-100 l/giếng
(Hình 3.1). Bằng phương pháp xác định hoạt độ đã xác định được hoạt độ protease của dịch chiết enzyme thô đạt 15,2 ± 0,3 U/g. Như vậy, chủng A. oryzae VTCC-F-0187 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, không bị mất hoạt tính sinh tổng hợp enzyme sau quá trình bảo quản chủng giống.
3.2. Tối ưu các điều kiện sinh tổng hợp protease
3.2.1. Tối ưu tỉ lệ bột đậu tương và bột lõi ngô
Cơ chất đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật để sản sinh protease. Nồng độ cơ chất trong môi trường nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187. Tiến hành lên men xốp theo phương pháp đã mô tả. Sau 5 ngày lên men tiến hành thu dịch enzyme để xác định hoạt tính.
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất bột đậu tương/lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Kết quả cho thấy khi tăng tỉ lệ lõi ngô từ 55% đến 65% thì hoạt tính enzyme tăng, ở nồng độ 65% bột lõi ngô và 35% bột đậu tương, hoạt tính
protease cao nhất đạt 18 U/g. Khi tiếp tục tăng tỉ lệ lõi ngô thì hoạt tính enzyme giảm, giảm mạnh nhất ở nồng độ 5% bột đậu tương và 95% lõi ngô (giảm 25%) và đạt 13,5 U/g (Hình 3.2 và Phụ lục 1). Như vậy, tỉ lệ bột lõi ngô và bột đậu tương thích hợp nhất cho A. oryzae lên men sinh tổng hợp protease tương ứng là 65% và 35%.
Ở các nghiên cứu trước, sử dụng cơ chất là bột khoai tây để lên men rắn sản xuất protease từ A. oryzae có thể đạt 18,68 U/g [30]. Chủng Aspergillus niger nuôi trên nền cơ chất là bột hướng dương thì hoạt tính protease có thể đạt 5,2 U/g [18]. Như vậy, sử dụng hỗn hợp cơ chất là bột đậu tương và bột lõi ngô để cấy chủng A. oryzae thì hoạt tính enzyme protease tương đương khi sử dụng cơ chất là bột khoai tây, đồng thời cao hơn chủng A. niger nuôi trên nền cơ chất là bột hướng dương.
3.2.2. Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 nuôi trong môi trường cơ chất với tỉ lệ 35% bột đậu tương, tỉ lệ lõi ngô giảm từ 60% đến 20% và tỉ lệ cám gạo được bổ sung thay đổi từ 5% đến 45%, ở pH 7, nhiệt độ 33C, độ ẩm 70%, khoáng Czapeck. Sau 5 ngày nuôi cấy tiến hành thu dịch enzyme để xác định hoạt tính.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khả năng sinh protease của chủng nghiên cứu trong môi trường có thêm nguồn cám cao hơn với môi trường chỉ có bột đậu tương và lõi ngô. Protease được sinh tổng hợp trong môi trường có bổ sung thêm cám gạo đạt 19,7 U/g, (Hình 3.3 và phụ lục 2). Nồng độ cám gạo bổ sung tăng từ 5% đến 10% thì hoạt tính enzyme protease tăng nhưng sau đó hoạt tính lại giảm khi tiếp tục tăng tỉ lệ cám gạo. Như vậy, hỗn hợp 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo là nguồn cơ chất phù hợp cho chủng A. oryzae
Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
3.2.3. Tối ưu độ ẩm
Độ ẩm ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của chủng nấm trong quá trình lên men xốp. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiếp tục tiến hành lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong môi trường cơ chất có tỉ lệ % Bột đậu tương: Lõi ngô: Cám gạo là 35:55:10, ở pH 7, nhiệt độ 330C, khoáng Czapeck, độ ẩm ban đầu thay đổi từ 50% đến 90%. Sau 5 ngày nuôi cấy thu dịch enzyme để xác định hoạt tính, đánh giả ảnh hưởng của độ ẩm.
Kết quả cho thấy, khi độ ẩm tăng từ 50% đến 60% thì hoạt tính enzyme tăng, hoạt tính đạt tối đa là 22,2 U/g ở độ ẩm 60%. Điều này có thể do tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm cơ chất phồng lên, tăng độ xốp, tạo điều kiện cho nấm dễ dàng tiếp xúc với cơ chất hơn. Sau đó, tiếp tục tăng độ ẩm của môi trường lên thì hoạt tính của enzyme giảm và hoạt tính chỉ còn 16,6 U/g ở độ ẩm 90% (Hình 3.4 và phụ lục 3). Như vậy, ở độ ẩm 60% từ nguồn khoáng czapek khả năng lên men sinh tổng hợp enzyme protease của A. oryzae là tốt nhất. Như
vậy, độ ẩm 60% là độ ẩm tốt nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm tới khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Trong các nghiên cứu trước đây, A. oryzae var. brunneus WO3 nuôi trên cơ chất cơm trắng có hàm lượng nước ban đầu là 40% là phù hợp cho sự phát triển [26]. Aspergillus oryzae (Ozykat-1) nuôi trên chất nền có cám lúa mì và cám gạo 33% thì độ ẩm tối ưu là 50% [13]. Như vậy chủng A. oryzae VTCC- F-0187 nuôi trong hỗn hợp 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo có độ ẩm tối ưu cao hơn các thí nghiệm trên và đạt 60%.
3.2.4. Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 được nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau từ 25 - 35C trong môi trường có tỉ lệ bột đậu tương : lõi ngô : cám gạo tương ứng là 35% : 55% : 10%, khoáng Czapeck, độ ẩm 60%, pH 7. Sau 5 ngày nuôi cấy thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính.
Kết quả cho thấy, khi tăng nhiệt độ từ 25 – 30C sinh tổng hợp protease tăng lên và hoạt tính enzyme đạt cao nhất là 23,7 U/g ở nhiệt độ 30C và giảm dần khi tăng nhiệt độ lên 33C và 35C (Hình 3.5 và phụ lục 4).
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Những nghiên cứu trước đây cho thấy, A. oryzae LBA 01 có phạm vi nhiệt độ tối ưu cho hoạt động là 55-60°C [32]. A. niger nuôi trên cơ chất bột hướng dương có nhiệt độ tối ưu là 30°C [18]. A. clavatus có nhiệt độ tối ưu là 40°C [33]. A. oryzae LK-101 có nhiệt độ tối ưu 50°C [30]. Như vậy, nhiệt độ tối ưu của A. oryzae VTCC-F-0187 bằng của A. niger nhưng thấp hơn của A.