3. Nội dung nghiên cứu
3.3. Sản xuất chế phẩm
Sau khi tìm được các điều kiện tối ưu về môi trường nuôi cấy, tiến hành lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong hỗn hợp cơ chất 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo, với độ ẩm ban đầu là 60%, pH ban đầu bằng 6, ở nhiệt độ 30C trong tủ điều khiển nhiệt độ, có không khí lưu thông. Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH, thời gian lên men 6 ngày (Hình 3.8). Khi đã trộn giống xong, môi trường được trải lên các khay có kích thước 30x50 cm, phủ báo đã khử trùng để lên men. Kết thúc quá trình lên men tiến hành chiết enzyme được chế phẩm enzyme thô (Hình 3.9).
Hình 3.8. Quy trình lên men sản xuất chế phẩm protease từ A. Oryzae
VTCC – F - 0187
A B C
Hình 3.9. Lên men chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease
độ; C: Cơ chất sau lên men
Kết quả hình 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp protease của chủng
A. oryzae VTCC-F-0187 lần 1 đạt 27,2 U/g, lần 2 đạt 27 U/g, lần 3 đạt 27 U/g. Như vậy, chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease ổn định trong các điều kiện tối ưu ổn định sau các lần lên men. So sánh với điều kiện chưa tối ưu, khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 đã tăng 76,5% từ 15,3 U/g lên 27 U/g. Dịch chiết enzyme thô có thể được sử dụng để đông khô tạo chế phẩm enzyme protease bổ sung vào thức ăn chăn nuôi.
Hình 3.10. Khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 trong điều kiện tối ưu sau các lần lên men
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào, không bị mất hoạt tính sinh tổng hợp enzyme sau quá trình bảo quản chủng giống.
2. Chủng A. oryzae VTCC-F-0187 có khả năng tổng hợp protease cao nhất khi lên men trên hỗn hợp cơ chất gồm 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô và 10% cám gạo. Điều kiện để chủng A. oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease tối ưu là: độ ẩm ban đầu 60%, nhiệt độ 30C, pH ban đầu bằng 6 và thời gian lên men là 6 ngày.
3. Đã tiến hành lên men thu dịch enzyme thô có thể sản xuất chế phẩm và đánh giá được sự ổn định sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC- F-0187 trong điều kiện tối ưu.
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm lên men lượng lớn với nguồn cơ chất là bột đậu tương, lõi ngô và cám gạo trong điều kiện tối ưu.
2. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lượng của vật nuôi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Hiền (2012), Công nghệ sản xuất enzyme, protein và ứng dụng, NXB giáo dục Việt Nam.
2. Nguyễn Đức Lượng (2012), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
3. Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006), "Khảo sát một số tính chất của chế phẩm Protease từ canh trường nuôi cấy bề mặt Aspergillus oryzae
và ứng dụng Enzyme trong sản xuất nước mắm", Tạp chí phát triển khoa học và công nghệ, 9 (5), Tr. 53-58.
4. Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
5. Bùi Thị Nhung (2013), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có trong natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng, Luận văn thạc sĩ - Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.
6. Lương Đức Phẩm (2010), Giáo trình Công nghệ lên men, NXB giáo dục Việt Nam.
7. Nguyễn Thị Thảo (2005), Tối ưu các điều kiện nuôi cấy chủng Sertia sp. DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào và xác định tính chất lí hóa, Luận văn thạc sĩ - Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật.
8. Đặng Thị Thu (2012), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
9. Đồng Thị Thanh Thu (2004), Nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzyme protease từ vi sinh vật để ứng dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm, Luận văn thạc sĩ - Trường Đại học Khoa học tự nhiên - thành phố Hồ Chí Minh.
10. Đỗ Thị Bích Thủy (2012), "Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự thu nhận chế phẩm protease ngoại bào của Bacillus amyloliquefacien N1", Tạp chí khoa học - Đại học Huế, 71(2), Tr. 279-290.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
11. Amri E., Mamboya F. ( 2012), "Papain, a Plant Enzyme of Biological Importance: A Review ", American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 8, pp. 99-104.
12. Bennett J. W. (2010), "An Overview of the Genus Aspergillus", Caister Academic Press, 978, pp. 55-53.
13. Chutmanop J., Chuichulcherm S., Chisti Y., Srinophakun P. (2008), "Protease production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates", Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 83, pp. 1012–1018.
14. Galagan J. E., Calvo S. E., Cuomo C., Ma L. J., Wortman J. R., Batzoglou S., Lee S. I., Basturkmen M. (2005), "Sequencing of Aspergillus nidulans
and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus oryzae", Nature, 438, pp. 1105-1115.
15. Geiser D. (2009), "Sexual structures in Aspergillus: morphology, importance and genomics", Medical mycology, 47, pp. 21-26.
16. Gotou T., Shinoda T., Mizuno S., Yamamoto N. (2009), "Purification and identification of proteolytic enzymes from Aspergillus oryzae capable of producing the antihypertensive peptidee Ile-Pro-Pro", Journal of Bioscience and Bioengineering, 107, pp. 615–619.
17. Gradman A. H., Kad R. (2008), "Renin Inhibition in Hypertension",
18. Hamid M., Ikram-Ul H. (2009), "Production of Acid Protease by
Aspergillus niger Using Solid State Fermentation", Pakistan J. Zool, 41, pp. 253-260.
19. Kitamoto K. (2002), "Molecular biology of te Koij molds", Adv in Appl Microbiol, 51, pp. 129-153.
20. Klich M. A. (2002), Identification of common Aspergillus species, Trakya University.
21. Li-Jung Y., Ya-Hui C., Shann-Tzong J. (2013), "Purification and characterization of acidic protease from Aspergillus oryzae BCRC 30118",
Journal of Marine Science and Technology, 21, pp. 105-110.
22. Li C., Xu D. (2014), "Production optimization, purification, and characterization of a novel acid protease from a fusant by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger", European Food Research and Technology, 238, pp. 905–917.
23. Machida M., Asai K. S., M. et al. (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438, pp. 1157–1161.
24. Matsushita-Morita M., Tada S., Suzuki S. e. a. (2011), "Overexpression and characterization of an extracellular Leucine Aminopeptidease from Aspergillus oryzae", Current Microbiology, 62, pp. 557–564.
25. Nafisa Saddig A. A. (2016), Optimization of Conditions for Protease Production from Aspergillus niger under Solid State Fermentation, University of Khartoum.
26. Narahara H., Koyama Y., Yoshida T., Pichangkura S., Ueda R., Taguchi H. (1982), "Growth and enzyme production in a solid state culture of
Aspergillus oryzae", Journal of Fermentation Technology, 60, pp. 311- 320.
27. Ramakrishna V., Rajasekhar S., Reddy L. S. (2010), "Identification and purification of metalloprotease from dry grass pea (Lathyrus sativus L.) seeds", Applied Biochemistry and Biotechnology, 160, pp. 63-71.
28. Rao M. B., Tanksale A. M., Ghatge M. S., Deshpande V. V. (1998), "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases",
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, pp. 597-635.
29. Shivakumar S. (2012), "Production and characterization of an acid Protease from a local Aspergillus Sp. by solid substrate fermentation", Scholars Research Library, 4, pp. 188-199.
30. Si-Kyung, Joo-Yeon L., Hwa H., Kim C. M. (2010), "Purification and characterization of Aspergillus oryzae LK-101 salt-tolerant acid protease isolated from soybean paste", Food Science and Biotechnology, 19, pp. 327–334.
31. Silva T. A. S., Knob A., Tremacoldi C. R., Brochetto-Braga M. R., Carmona E. C. (2011), "Purification and some properties of an extracellular acid protease from Aspergillus clavatus", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27, pp. 2491–2497.
32. Soares de Castro R. J., Sato H. H. (2014), "Protease from Aspergillus oryzae: Biochemical Characterization and Application as a Potential Biocatalyst for Production of Protein Hydrolysates with Antioxidant Activities", Journal of Food Processing, 372352, pp. 905-917.
33. Tremacoldi C. R., Watanabe N. K., Carmona E. C. (2004), "Production of Extracellular Acid Proteases by Aspergillus Clavatus", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 20, pp. 639–642.
34. Vishwanatha K. S., Appu Rao A. G., Singh S. A. (2009), "Characterisation of acid protease expressed from Aspergillus oryzae MTCC 5341", Food Chemistry, 114, pp. 402-407.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BĐT/Lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Tỷ lệ BĐT/ LN 45:55 40:60 35:65 30:70 25:75 20:80 15:85 10:90 5:95 OD1 0,502 0,541 0,581 0,508 0,499 0,492 0,47 0,469 0,45 OD2 0,498 0,552 0,595 0,51 0,508 0,51 0,49 0,457 0,439 OD3 0,505 0,537 0,582 0,505 0,498 0,492 0,472 0,455 0,44 HSPL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 HT1 15,4 16,6 17,8 15,5 15,3 15,0 14,4 14,3 13,8 HT2 15,2 16,9 18,2 15,6 15,5 15,6 15,0 14,0 13,4 HT3 15,5 16,4 17,8 15,5 15,2 15,0 14,4 13,9 13,4 HTtb 15,3 16,6 18,0 15,5 15,3 15,2 14,6 14,1 13,5 SS 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2
Phụ lục 2. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
nồng độ 5 10 15 20 25 30 35 40 45 OD1 0,602 0,641 0,621 0,578 0,519 0,492 0,47 0,429 0,32 OD2 0,598 0,652 0,615 0,51 0,508 0,481 0,46 0,427 0,319 OD3 0,585 0,637 0,612 0,525 0,498 0,492 0,472 0,415 0,34 HSPL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 HT1 18,4 19,7 19,0 17,7 15,9 15,0 14,4 13,1 9,7 HT2 18,3 20,0 18,8 15,6 15,5 14,7 14,1 13,0 9,7 HT3 17,9 19,5 18,8 16,1 15,2 15,0 14,4 12,7 10,4 HTtb 18,2 19,7 18,9 16,5 15,6 14,9 14,3 12,9 9,9 SS 0,3 0,2 0,1 1,1 0,3 0,2 0,2 0,2 0,4
Phụ lục 3. Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
pH OD1 OD2 OD3 HS
PL HT1 HT2 HT3 HTtb SS 3 0,65 0,637 0,62 5 19,9 19,5 19,0 19,5 0,5 4 0,68 0,701 0,712 5 20,8 21,5 21,8 21,4 0,5 5 0,758 0,753 0,739 5 23,2 23,1 22,6 23,0 0,3 6 0,831 0,82 0,802 5 25,5 25,1 24,6 25,1 0,5 7 0,745 0,793 0,781 5 22,8 24,3 23,9 23,7 0,8 8 0,67 0,672 0,689 5 20,5 20,6 21,1 20,8 0,3
Phụ lục 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187 Nhiệt độ 1 2 3 HS PL HT1 HT2 HT3 HTtb SS 25 0,515 0,494 0,485 5 15,7 15,1 14,8 15,2 0,5 28 0,65 0,656 0,656 5 19,9 20,1 20,1 20,1 0,1 30 0,778 0,762 0,772 5 23,8 23,3 23,6 23,7 0,2 33 0,723 0,714 0,726 5 22,1 21,9 22,2 22,1 0,2 35 0,521 0,545 0,529 5 15,9 16,6 16,1 16,3 0,4
Phụ lục 5. Ảnh hưởng của độ pH đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
pH OD1 OD2 OD3 HS
PL HT1 HT2 HT3 HTtb SS 3 0,65 0,637 0,62 5 19,92896 19,52741 19,00232 19,5 0,5 4 0,68 0,701 0,712 5 20,8556 21,50425 21,84402 21,4 0,5 5 0,758 0,753 0,739 5 23,26486 23,11042 22,67799 23,0 0,3 6 0,831 0,82 0,802 5 25,51969 25,17992 24,62394 25,1 0,5 7 0,745 0,793 0,781 5 22,86332 24,34595 23,97529 23,7 0,8 8 0,67 0,672 0,689 5 20,54672 20,60849 21,13359 20,8 0,3
Phụ lục 6. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng A. oryzae VTCC-F-0187
Ngày OD1 OD2 OD3 hspl HT1 HT2 HT3 HTtb SS
1 0,265 0,251 0,248 5 8,0 7,6 7,5 7,7 0,3 2 0,376 0,357 0,382 5 11,4 10,8 11,6 11,3 0,4 3 0,61 0,61 0,621 5 18,6 18,6 19,0 18,8 0,2 4 0,702 0,723 0,725 5 21,5 22,1 22,2 22,0 0,4 5 0,819 0,809 0,822 5 25,1 24,8 25,2 25,1 0,2 6 0,862 0,886 0,897 5 26,4 27,2 27,5 27,1 0,6 7 0,73 0,742 0,721 5 22,4 22,7 22,1 22,4 0,3 8 0,609 0,631 0,627 5 18,6 19,3 19,2 19,1 0,4
Phụ lục 7. Lên men sản xuất chế phẩm protease của chủng A. oryzae VTCC-F- 0187
Lần OD1 OD2 OD3 Hs
pl HT1 HT2 HT3 HT tb SS Lần 1 0,879 0,899 0,882 5 27,0 27,6 27,1 27,2 0,3 Lần 2 0,862 0,886 0,887 5 26,4 27,2 27,2 27,0 0,4 Lần 3 0,86 0,882 0,891 5 26,4 27,1 27,4 27,0 0,5