Phƣơngpháp tinh chế mRNA

CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 Phƣơngpháp nghiên cứu

2.2.2 Phƣơngpháp tinh chế mRNA

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Dynabeads mRNA DIRECT TM Micro Kit (Life technology) để tiến hành tinh chế mRNA từ RNA tống số, cụ thể nhƣ sau:

1. Chuẩn bị

 Đƣa hạt Dynabeads về nhiệt độ phòng.

 Ủ với nƣớc siêu sạch không chứa nuclease (180 µl /mẫu) tại 80C.

 Đặt bể ổn nhiệt 70C.

2. Thí nghiệm a) Rửa hạt beads

 Dùng pipet hút thể tích hạt beads phù hợp với lƣợng RNA tổng số đầu vào (100 µl).

 Đặt Ependorf chứa hạt bead lên giá từ, loại bỏ dịch nổi.

 Rửa lại hạt beads bằng thể tích tƣơng đƣơng Lysis/Binding Buffer.

 Vortex nhẹ, spin.

b) Xử lý mẫu RNA tổng số

Pha loãng mẫu RNA tổng số với nồng độ từ 20 – 50 µg trong tổng thể tích 300 µl bằng nƣớc deion không chứa nuclease.

c) Tinh sạch mRNA 2 lần qua cột

 Mẫu RNA sau pha loãng đƣợc xử lý nhiệt trong 2 phút 70C.

 Thêm thể tích tƣơng tự Lysis/Binding Buffer vào mỗi mẫu, trộn đều, spin nhẹ.

 Gắn mRNA vào hạt beads:

+ Chuyển hạt beads vào các giếng của phiến nhựa 96 giếng. + Bổ sung RNA đã xử lý nhiệt vào các giếng.

+ Mix hỗn hợp 10 lần bằng pipet, ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút.

+ Đặt phiến lên giá từ, khi dung dịch đã trong trở lại (hạt beads lắng xuống đáy) loại bỏ dịch trong.

 Rửa RNA

+ Chuyển phiến ra khỏi giá từ, bổ sung vào giếng 600 µl Washing buffer A, đảo lên xuống 10 lần bằng pipet.

+ Thực hiện tƣơng tự với Washing buffer B.

 Hòa lại RNA

Cặn hạt từ thu đƣợc sau khi rửa với Washing buffer B đƣợc hòa lại bằng 90 µl nƣớc deion (đã đƣợc ủ trƣớc ở 80C), trộn đều 10 lần và để nhiệt độ phòng 30 giây.

+ Bổ sung Lysis/Binding Buffer vào các giếng, trộn đều 10 lần. + Ủ nhiệt độ phòng 5 phút.

+ Đặt đĩa trên giá từ và loại bỏ dịch nổi. + Lặp lại bƣớc rửa mRNA.

 Hòa lại mRNA trong 30 µl nƣớc deion không chứa nuclease, sử dụng ngay để tổng hợp cDNA hoặc bảo quản trong tủ - 80oC.