CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phƣơngpháp nghiên cứu
2.2.3 Tạo thƣ viện cDNA
a)Cắt nhỏ mRNA sau khi tinh sạch
Bổ sung 19 µl RNA Seq Fragmentation Mix vào mỗi giếng của phiến 96 giếng chứa mRNA đã tinh chế.
Dán kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây. Li tâm nhanh phiến trong máy li tâm chuyên dụng để thu dịch trong.
Đặt phiến vào máy chu kỳ nhiệt và chạy chƣơng trình để phân cắt RNA: 94oC 8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4 o
C.
b) Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất:
Chuyển phiến chứa RNA đã phân cắt cùng với hạt từ từ máy chu kỳ nhiệt sang giá từ ở nhiệt độ phòng. Để phiến trên giá từ ít nhật 5 phút.
Nhẹ nhàng chuyển 17 µl dịch nổi chứa mRNA đã phân cắt sang phiến nhựa mới.
Bổ sung 8,5 µl of First Strand Master Mix/Actinomycin D mixture vào mỗi giếng chứa mRNA đã phân cắt.
Dán kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây.
Li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút.
Để phiến vào máy chu kỳ nhiêt và chạy chƣơng trình: bƣớc 1: 25o
C 10 phút, bƣớc 2: 37oC 40 phút, bƣớc 3: chyển sang giữ ở 4o
C.
Bổ sung 25 µl RNA Seq Second Strand + End Repair Enzyme Mix vào 20µl mẫu cDNA sợi thứ nhất đã chuẩn bị.
Bổ sung 5 µl RNA Seq Second Strand + End Repair Oligo Mix vào mỗi giếng, nhƣ vậy ta sẽ có 50 µl dịch trong mỗi giếng.
Gián kín phiến và lắc nhẹ nhàng trong 5 giây.
Li tâm phiến ở 1500 x g trong 1 phút.
d)Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor
Các đoạn DNA đã gắn Adaptor đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu gắn adaptor.
Phản ứng khuếch đại cDNA:
Thành phần Số lƣợng
Platinum® PCR SuperMix High Fidelity
45µl Miseq 5’ PCR Primer v2 1 µl
Miseq 3′ PCR Primer v2 1 µl
Tổng 47 47 µl
+ Chuyển 6 µl mẫu cDNA vào ống PCR mới
+ Chuyển 47µl PCR mix vào 6 µl mẫu cDNA ở trên + Đảo ống phản ứng để hòa tan đều
+ Chạy PCR với chu trình nhiệt nhƣ sau
Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian
Kéo dài 94 ºC 2 phút
Chu kỳ 1 (2 chu kỳ)
94 ºC 30 giây
50 ºC 30 giây
Chu kỳ 2 (14 chu kỳ)
94 ºC 30 giây
62 ºC 30 giây
68 ºC 30 giây
Kéo dài 68ºC 5 phút
Tinh sạch cDNA vừa khuếch đại: cDNA đƣợc tinh sạch bằng hạt từ (Nucleic Acid Beads) và các dung dịch đệm đƣợc cung cấp cùng với kit trên.
Thƣ viện cDNA sau khi tinh sạch đƣợc gửi đi giải mã trên hệ giải trình tự gen thế hệ mới Illumina MiSeq