Thu thập mẫu để chẩn đoán virus cần quan tâm đến thời gian lấy mẫu sau khi mắc, vị trí lấy mẫu, cách bảo quản và vận chuyển có liên quan đến kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm.
Để phân lập virus, mẫu bệnh phẩm cần thu thập trong giai đoạn sớm của bệnh (thời gian nhiễm virus huyết) và trong suốt thời gian đào thải virus.
Để chẩn đoán huyết thanh, các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục cần được lấy theo đúng thời gian quy định, ví dụ như mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp được lấy càng sớm càng tốt, mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn hồi phục lấy sau đó 2 - 4 tuần.
Lựa chọn loại mẫu để thu thập đối với từng bệnh đòi hỏi có sự hiểu biết về bệnh sinh của bệnh đó.
1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định týp virus
Phân lập chủng virus
Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [17]. Chủng virus phân lập được trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng như sự biến đổi di truyền và tính chất kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự lan truyền của chủng một virus mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm phù hợp.
Việc phân lập virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và A/H3N2 được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng tế bào cảm thụ MDCK. Virus cúm B có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm trên người. Ưu điểm của phương pháp phân lập trên tế bào MDCK là đơn giản, thuận tiện, dễ thực hiện, có thể phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong một lần tiến hành. Để sản xuất vắc xin thì phương pháp phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virus với hiệu giá cao [24,
43]. Việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [14, 29].
Ngoài ra đối với virus cúm gia cầm (cúm A/H5N1): là virus nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virus phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 và được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi.
Định týp virus: virus sau khi phân lập được định týp (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme và khi giải trình tự thường sử dụng các máy phân tích chuỗi tự động như ABI PRISM 3130-Avant (Applied Biosystems), hoặc Beckman Coulter (Mỹ). Để thực hiện được giải trình tự của các máy tự động thì các mach ADN đơn sản sinh ra trong ống nghiệm phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser [8].
Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính là phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide là các ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Trong suốt quá trình điện
di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn ADN.
Phương pháp xác định trình tự gen đóng một vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu đặc điểm di truyền học, so sánh giữa các gen của virus cúm để xây dựng cây gia hệ. Qua đó có thể xác định được tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virus, giảm độ nhạy của thuốc kháng virus và phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của các chủng virus cúm đang lưu hành.
Chương II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là tổng số 115 chủng virus cúm B được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng thu thập trên bệnh nhân hội chứng cúm trong 3 năm (2010 - 2012) tại Hà Nội và các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Các chủng virus cúm này được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Cúm - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Chủng virus cúm B
Các chủng phân lập virus cúm B được sử dụng trong nghiên cứu cần có hiệu giá virus đạt ≥ 8 đơn vị HA xác định bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA).
2.2.2. Sinh phẩm
2.2.2.1. Sinh phẩm sử dụng cho định týp virus
Bộ sinh phẩm kháng huyết thanh chuẩn dùng trong phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) để định týp virus cúm được TCYTTG cung cấp hàng năm (2010 - 2012) tùy theo từng năm.
Kháng nguyên chuẩn (reference antigens)
Kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera)
A/H1N1 A/H1N1
A/H3N2 A/H3N2
B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage)
B/Florida/4/2006 (B/Yamagata lineage) hoặc B/Wisconsin/01/2010 (B/Yamagata lineage) B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage) B/Brisbane/60/2008 ( B/Victoria lineage)
2.2.2.2. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen
- Uni 12 primer (CDC - Mỹ)
- cADN SuperscriptIII Reverse Transcriptase, P/N 02321, Invitrogen
- Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Qiaquick PCR Purification kit 250, Cat.No. 28106, Qiagen và Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706, Qiagen.
- Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle sequencing): BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N: 4336917,ABI.
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide : Big Dye X Terminator Purification Kit, Cat. No. 4376486, ABI.
- Hệ thống mồi: Tên mồi Trình tự HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA HA-36F GAAGGCAATAATTGTACT HA-482F GCAACAATGGCTTGGGC HA-660R TATCAGAGTGGAACCCC HA-760R GCCGCCAATCTGAGAAAC HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA NA-560F CTCCATTTTCCACATGGCAGCTTG NA-620R ATTACTGTCAGGGCCATCAAC NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA
2.2.3. Trang thiết bị và dụng cụ
2.2.3.1. Trang thiết bị
Trang thiết bị Hãng
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 2 Viện VSDTTƯ Tủ an toàn sinh học cấp độ 2 (Biosafety Cabinet - Class2) Bioquell - Anh
Tủ ấm CO2 Jouan - Pháp
Tủ lạnh 4oC, - 20oC và - 80oC Sanyo - Nhật Máy li tâm Rotofex - Mỹ Máy khuếch đại gen Biorad - Mỹ Máy phân tích trình tự gen ABI-3130 Avant Hitachi - Nhật Máy lắc (vortex) IKA - Malaysia
2.2.3.2. Dụng cụ
- Phiến nhựa 96 giếng, đáy chữ U và đáy chữ V.
- Pipet tự động vi lượng các loại từ 0,5µl đến 1000µl.
- Pipet đa kênh các loại từ 20µl đến 300µl.
- Đầu côn vô trùng các loại, có phin lọc từ 0,5µl đến 1000µl.
- Tuýp eppendorf các loại từ 0,2ml đến 1,5ml. Và các dụng cụ thí nghiệm cần thiết khác.
2.3. PHƯƠNG PHÁP
2.3.1. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
2.3.1.1. Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp này được tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy chữ V (hồng cầu gà) hoặc phiến nhựa 96 giếng đáy chữ U (hồng cầu chuột lang).
Các bước tiến hành:
(1) Chuẩn bị hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% trong dung dịch đệm PBS, pH 7,2.
(2) Cho 50µl đệm PBS vào các giếng từ hàng thứ 2 đến hàng thứ 12.
(3) Cho 100µl hỗn dịch nuôi cấy virus vào giếng đầu tiên. Trộn đều và chuyển 50µl hỗn dịch này sang giếng thứ 2, pha loãng bậc 2 hỗn dịch nuôi cấy virus từ hàng thứ 2 đến 12. Loại bỏ 50µl ở hàng cuối cùng.
(4) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào toàn bộ 96 giếng. Lắc đều, ủ 30 phút (với hồng cầu gà) hoặc 60 phút (với hồng cầu chuột lang) ở nhiệt độ phòng.
Nhận định kết quả: Hiệu giá kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của
kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Đó chính là một đơn vị ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên, 50µl kháng nguyên 8 đơn vị hay 25µl kháng nguyên 4 đơn vị.
2.3.1.2. Định týp virus bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI)
Xử lý kháng huyết thanh chuẩn:
Trước khi tiến hành phản ứng HI cần xử lý kháng huyết thanh chuẩn để loại bỏ những chất ức chế không đặc hiệu có trong kháng huyết thanh chuẩn.
(1) Cho 1 thể tích kháng huyết thanh kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE (enzyme phá hủy các thụ thể-Recepter Destroying Enzyme). Ủ 37oC trong 18 giờ hoặc qua đêm.
(2) Bất hoạt tại nhiệt độ 56oC trong vòng 30 phút.
(3) Bổ sung 6 thể tích nước muối sinh lý NaCl 0,85% để kháng huyết thanh chuẩn được pha loãng 1/10.
(1) Cho 25µl đệm PBS vào các giếng từ hàng B tới hàng H (trừ cột 6 và cột 12) của tấm nhựa 96 giếng. Cột 6 và cột 12 cho 50µl đệm PBS.
(2) Cho 50µl kháng huyết thanh chuẩn đã xử lý vào hàng A (trừ các giếng A6, A12)
(3) Hút từ hàng A chuyển xuống hàng B 25µl kháng huyết thanh chuẩn và bắt đầu pha loãng bậc 2 từ hàng B tới hàng H, tại hàng H bỏ đi 25µl. Cột 6 và cột 12 giữ nguyên.
(4) Cho thêm 25µl kháng nguyên 4 đơn vị HA thích hợp (dịch nuôi cấy tế bào và chứng dương) vào các giếng tương ứng. Lắc nhẹ để kháng nguyên và kháng huyết thanh tiếp xúc với nhau rồi để ủ ở nhiệt độ phòng trong 1h.
(5) Cho 50µl hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% vào tất cả các giếng. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Nhận định kết quả:
- Phản ứng đọc được khi:
+ Kháng huyết thanh chuẩn: ngăn ngưng kết hoàn toàn.
+ Chứng hồng cầu: ngăn ngưng kết hoàn toàn.
- Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của chủng virus: là giá trị tại độ pha loãng cao nhất của kháng huyết thanh chuẩn và chủng virus gây nên hiện tượng ngăn ngưng kết hồng cầu.
- Phân týp của virus được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu giá ngăn ngưng kết hồng cầu cao nhất.
2.3.2. Giải trình tự gen
2.3.2.1. Tách chiết vật liệu di truyền từ chủng virus cúm phân lập được
Sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, Cat No 52904, Qiagen. Các bước thực hiện tách chiết theo thường quy bộ sinh phẩm như sau:
(1) Trộn đều 140µl mẫu (dịch nổi phân lập thu hoạch được) với 560µl đệm
AVL. Ủ tại nhiệt độ phòng trong 10 phút.
(2) Thêm 560µl Ethanol tuyệt đối (100%) vào hỗn dịch trên, lắc đều bằng máy vortex rồi li tâm nhẹ.
(3) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch. Chuyển 630µl hỗn dịch trên vào cột QIAamp spin. Li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li tâm. Sau đó lặp lại bước (3).
(4) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500µl dung dịch đệm AW1, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li tâm.
(5) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm 2ml sạch, tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500µl dung dịch đệm AW2, li tâm 14000 vòng/phút/3 phút. Loại bỏ dung dịch trong tuýp li tâm.
(6) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp li tâm vừa được loại bỏ dung dịch. Li tâm 14000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ tuýp li tâm.
(7) Đặt cột QIAamp spin vào tuýp eppendorf 1,5ml sạch. Cho 60µl dung dịch đệm AVE vào chính giữa màng lọc của cột, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần dung dịch thu được trong tuýp li tâm chính là ARN của chủng virus thu thập được.
(8) Bảo quản ARN tại -20oC hoặc -80oC.
2.3.2.2. Tổng hợp sợi ADN bổ sung (cDNA)
Với những đoạn gen có kích thước > 1000bp, cần phải tổng hợp sợi ADN bổ trợ sau đó mới thực hiện phương pháp PCR.
Hôn hợp 1
Thành phần Thể tích(µl)
Mồi Uni 12 (10µM) 5 dNTP (10µM) 1
ARN 10
Tổng 16
Ủ hỗn hợp này ở 65oC / 5 phút. Giữ lạnh ngay trong đá.
Hỗn hợp 2 Thành phần Thể tích(µl) Buffer 5x 5 DTT (0,1M) 1 RNase inhibitor 1 SuperSriptIII (200U/µl) 1 Tổng 8 Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2 rồi ủ 50oC/45 phút, 70oC/15 phút. 2.3.2.3. Thực hiện PCR
Sử dụng bộ sinh phẩm Hotstar Hifidelity Polymerase Kit, Cat No 202605, Qiagen.
Thành phần Thể tích(µl)
Đệm 5x 10 Mồi xuôi (100pmol) 0,5 Mồi ngược (100pmol) 0,5 Hifi Taq polymerase 2 Nước cất tinh khiết 31
cADN 6
Tổng 50
Mồi sử dụng trong phản ứng này là:
Tên mồi Trình tự HA-25F ATCCACAAAATGAAGGCA HA-1140R ACCAGCAATAGCTCCGAA NA-F1 AGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAA NA-1557R AGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGAAA Chu kỳ nhiệt: (1) 95oC trong 5 phút (2) 94oC 15 giây lặp lại (2) 35 lần 50oC 1 phút 68oC 2 phút (3) 68oC 10 phút (4) 10oC ∞
Điện di sản phẩm PCR: Sử dụng thạch 1% và thang trọng lượng phân tử
1kb (Hãng Promega).
2.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR nhằm loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa trong quá trình PCR để tránh gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.
Nếu sản phẩm PCR sau điện di cho kết quả đặc hiệu: sử dụng bộ sinh phẩm Qiaquick PCR Purification kit 250, Cat.No. 28106, Qiagen để tinh sạch.
Thành phần của bộ Kit: + Cột Quiquick 250 chiếc + Đệm PB 150ml + Đệm PE 55ml + Đệm EB 15ml + Tuýp 2 ml: 250 chiếc
Trước khi tiến hành tinh sạch, cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96 - 100%) vào đệm PE.
Các bước tiến hành:
(1) Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có.
(2) Dùng pipet chuyển toàn bộ hỗn dịch đã trộn ở bước (1) vào cột Qiaquick đặt trong tuýp 2ml, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(3) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.
(4) Dùng pipet hút 750µl đệm PE cho vào cột Qiaquick để rửa ADN, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(5) Loại bỏ dung dịch rửa ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch rửa.
(6) Chuyển cột Qiaquick sang tuýp eppendorf 1,5ml sạch đã chuẩn bị sẵn.
(7) Cho 30µl đệm EB vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, li tâm 13000 vòng/phút/1phút. Sản phẩm thu được chính là ADN đã được tinh sạch. ADN sau khi tinh sạch giữ ở - 20oC đến -80oC.
Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di không cho kết quả đặc hiệu: Sử dụng bộ sinh phẩm Qiaquick Gel Extraction kit 250, Cat.No. 28706, Qiagen.
Thành phần bộ Kit: + Cột Qiaquick 250 chiếc + Đệm QG 150ml + Đệm PE 55ml + Đệm EB 15ml + Tuýp 2ml 250 chiếc
Trước khi tiến hành tinh sạch cần thêm 220ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trước khi sử dụng.
Các bước tiến hành:
(1) Cắt băng sản phẩm cần giải trình tự trên thạch 1% đã điện di (dưới đèn chiếu tia cực tím)
(2) Cân trọng lượng thạch chứa băng sản phẩm. Cho 3 lần thể tích dung dịch đệm QG vào 1 lần thể tích thạch (100µg ≈ 100µl)
(3) Ủ tại 50oC trong 10 phút cho tới khi thạch tan hết trong dung dịch đệm QG. Để thạch có thể tan nhanh hơn có thể lắc tuýp bằng máy lắc sau mỗi 2-3 phút ủ.
(4) Đặt cột Qiaquick vào tuýp 2ml.
(5) Dùng pipet chuyển 750µl hỗn dịch ở bước (3) sang cột Qiaquick, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(6) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp.
(7) Lặp lại bước (5) và (6) cho tới khi hết hỗn dịch ở bước (3).
(8) Dùng pipet chuyển 500µl dung dịch đệm QG vào cột Qiaquick, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(9) Dùng pipet chuyển 750µl dung dịch đệm PE vào cột Qiaquick, li tâm 13000 vòng/phút/1 phút.
(10) Loại bỏ dung dịch ở tuýp 2ml, đặt lại cột vào tuýp, li tâm 13000