Để có thể chẩn đoán chính xác tác nhân gây bệnh của bệnh truyền nhiễm, chúng ta không thể chỉ dựa trên dấu hiệu lâm sàng và triệu chứng, vì một bệnh có thể có nhiều căn nguyên và mỗi căn nguyên có thể gây bệnh với những biểu hiện lâm sàng và triệu chứng nặng hay nhẹ khác nhau. Do đó việc chẩn đoán trong phòng thí nghiệm là rất quan trọng, giúp cho các nhà lâm sàng có thể chẩn đoán được chính xác.
Bên cạnh các kỹ thuật chẩn đoán cúm cơ bản, nhờ có sự phát triển của khoa học kỹ thuật mà ngày nay đã có nhiều các kỹ thuật chẩn đoán mới nhanh và hiện đại hơn. Nhờ đó sớm xác định được sự nhiễm virus cúm để có các biện pháp xử lý, cách li, điều trị kịp thời, giúp tránh lây nhiễm trong cộng đồng , tránh được những thiệt hại to lớn về tính mạng con người và kinh tế mà các vụ dịch cúm có thể gây ra. Quá trình phân tích các mẫu bệnh phẩm trong phòng thí nghiệm có giá trị quan trọng trong việc tìm hiểu đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh, quá trình sinh kháng thể sau khi lây nhiễm, cũng như quá trình khu trú và phát tán virus trong cơ thể.
1.7.1 An toàn phòng thí nghiệm
Trong phòng thí nghiệm chẩn đoán virus, làm việc với những mẫu bệnh phẩm lâm sàng có thể tiềm tàng tác nhân gây nhiễm dưới dạng khí dung, mà nhân viên phòng thí nghiệm có nguy cơ phơi nhiễm hàng ngày. Do đó, an toàn phòng thí nghiệm là hết sức quan trọng và cần thiết, trong quá trình làm việc cần có những trang thiết bị cũng như các phương tiện bảo hộ phù hợp để bảo vệ cả người làm việc cũng như công việc đang làm không bị nhiễm chéo.
1.7.2. Thu thập mẫu để chẩn đoán virus
Thu thập mẫu để chẩn đoán virus cần quan tâm đến thời gian lấy mẫu sau khi mắc, vị trí lấy mẫu, cách bảo quản và vận chuyển có liên quan đến kết quả chẩn đoán phòng thí nghiệm.
Để phân lập virus, mẫu bệnh phẩm cần thu thập trong giai đoạn sớm của bệnh (thời gian nhiễm virus huyết) và trong suốt thời gian đào thải virus.
Để chẩn đoán huyết thanh, các mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp và giai đoạn hồi phục cần được lấy theo đúng thời gian quy định, ví dụ như mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn cấp được lấy càng sớm càng tốt, mẫu huyết thanh lấy trong giai đoạn hồi phục lấy sau đó 2 - 4 tuần.
Lựa chọn loại mẫu để thu thập đối với từng bệnh đòi hỏi có sự hiểu biết về bệnh sinh của bệnh đó.
1.7.3. Phương pháp phân lập chủng và định týp virus
Phân lập chủng virus
Phân lập virus được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [17]. Chủng virus phân lập được trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học cũng như sự biến đổi di truyền và tính chất kháng nguyên, từ đó có thể dự đoán được sự lan truyền của chủng một virus mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm phù hợp.
Việc phân lập virus cúm B cùng với các virus cúm mùa khác là A/H1N1 và A/H3N2 được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 và sử dụng dòng tế bào cảm thụ MDCK. Virus cúm B có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virus cúm trên người. Ưu điểm của phương pháp phân lập trên tế bào MDCK là đơn giản, thuận tiện, dễ thực hiện, có thể phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm trong một lần tiến hành. Để sản xuất vắc xin thì phương pháp phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virus với hiệu giá cao [24,
43]. Việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [14, 29].
Ngoài ra đối với virus cúm gia cầm (cúm A/H5N1): là virus nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virus phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 và được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi.
Định týp virus: virus sau khi phân lập được định týp (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.4. Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme và khi giải trình tự thường sử dụng các máy phân tích chuỗi tự động như ABI PRISM 3130-Avant (Applied Biosystems), hoặc Beckman Coulter (Mỹ). Để thực hiện được giải trình tự của các máy tự động thì các mach ADN đơn sản sinh ra trong ống nghiệm phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser [8].
Cấu tạo của một máy giải trình tự tự động gồm hai phần chính là phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di. Phần điện di polyacrylamide là các ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Trong suốt quá trình điện
di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ ánh sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn ADN.
Phương pháp xác định trình tự gen đóng một vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu đặc điểm di truyền học, so sánh giữa các gen của virus cúm để xây dựng cây gia hệ. Qua đó có thể xác định được tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virus, giảm độ nhạy của thuốc kháng virus và phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của các chủng virus cúm đang lưu hành.
Chương II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là tổng số 115 chủng virus cúm B được phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng thu thập trên bệnh nhân hội chứng cúm trong 3 năm (2010 - 2012) tại Hà Nội và các tỉnh miền Bắc Việt Nam. Các chủng virus cúm này được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Cúm - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.