2012
3.4. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ PROTEIN NA CÁC CHỦNG
3.4.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B
Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả khuếch đại đoạn gen NA của virus cúm B bằng phương pháp PCR cho sản phẩm có kích thước băng đặc hiệu là 1557bp (hình 3.12). Đoạn gen này sau khi tinh sạch đã được loại bỏ những sản
phẩm thừa không đặc hiệu trong quá trình phản ứng (hình 3.13). Sản phẩm tinh sạch này được sử dụng trong quá trình giải trình tự.
Hình 3.12. Sản phẩm gen NA sau PCR
(M: Thang trọng lượng phân tử)
Hình 3.13. Sản phẩm gen NA sau khi tinh sạch
← NA 1557bp ← NA 1557bp 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
3.4.2. Cây gia hệ gen NA
Hình 3.14. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria và dòng B/Yamagata, 2010-2012
Chủng năm 2010 Chủng năm 2011 Chủng năm 2012 Chủng Vắc xin
Hình 3.15. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Victoria, 2010- 2012 Chủng năm 2010 Chủng năm 2011 Chủng năm 2012 Chủng Vắc xin
Hình 3.16. Cây gia hệ gen NA (1557 nucleotide) dòng B/Yamagata, 2010-2012
Chủng năm 2010 Chủng năm 2011 Chủng năm 2012 Chủng năm vắc xin
Cũng tương tự như gen HA, cây gia hệ gen NA được xây dựng dựa trên việc phân tích gen NA (1557 nucleotide) của 26 chủng virus cúm B phân lập được tại Việt Nam, 2010-2012, trong đó có 5 chủng thuộc năm 2010, 14 chủng thuộc năm 2011 và 7 chủng thuộc năm 2012. Cây gia hệ được thiết lập dựa trên các dữ liệu thu thập trên Genbank bao gồm các chủng vắc xin dự tuyển giai đoạn 2004-2012 (B/Victoria: B/ Malaysia/2506/2004, B/Ohio/1/2005, B/Brisbane/60/2008 và B/Yamagata: B/Floria/04/2006, B/Wisconsin/01/2010), các chủng virus cúm B lưu hành tại một số nước trên thế giới (Thái Lan, Trung Quốc, Úc, Mỹ...) và các chủng virus cúm B lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2010-2012.
Kết quả phân tích trên cây gia hệ NA cho thấy trong giai đoạn 2010-2012 cả 2 dòng kháng nguyên B/Vicroria (B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage) lưu hành đồng thời tại Việt Nam với số lượng chủng lần lượt là 19 và 7. Các virus cúm thuộc dòng B/Victoria được chia thành 2 phân nhóm là Victoria 1 (V1) và Victoria 2 (V2) trong đó phân nhóm V1 gồm chủ yếu các chủng lưu hành năm 2010-2011 (năm 2010, 2011 và 2012 là 3, 8 và 1 chủng) và phân nhóm V2 gồm các chủng lưu hành năm 2012 (6 chủng) và năm 2011 (1 chủng), tương đồng cao về mặt di truyền với các chủng virus tại Thái Lan, Trung Quốc... Cũng giống dòng B/Victoria, virus cúm dòng B/Yamagata trong giai đoạn nghiên cứu cũng được chia thành 2 phân nhóm Yamagata 1 (Y1) và Yamagata 2 (Y 2). Kết quả nghiên cứu cho thấy 7/7 chủng thuộc dòng B/Yamagata đều thuộc phân nhóm Y1, có độ tương đồng cao với chủng vắc xin B/Florida/04/2006 và các virus tại Thái Lan, Đài Loan, Nhật Bản...Vì số lượng virus được sử dụng để nghiên cứu gen NA không nhiều nên có thể không xác định được chủng virus nào trong nghiên cứu thuộc nhóm Y2, cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010 (hình 3.14 và hình 3.16).
Kết quả phân tích cây gia hệ gen cho thấy sự tiến hóa giữa gen HA và NA của virus cúm B dường như là giống nhau. Các virus trong nghiên cứu cùng thuộc nhóm di truyền giống nhau ở cả 2 gen HA và NA. Chỉ phát hiện duy nhất 1 chủng
(B/Vietnam/LS62/2012) có gen HA thuộc nhóm V2 nhưng gen NA thuộc nhóm V1. Tuy nhiên, hiệu giá của chủng virus này với kháng huyết thanh chuẩn tương đồng thuộc dòng B/Vicoria (B/Brisbane/60/2008 reference antisera) vẫn đạt hiệu giá bằng chủng chuẩn (HI = 160 ) (phụ lục). Điều này cho thấy tính kháng nguyên là không thay đổi, vẫn tương đồng với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008.
3.4.3. Protein NA
Cùng với protein HA, protein NA mặc dù không quyết định đặc tính kháng nguyên của virus nhưng protein NA là một trong 2 protein bề mặt có ảnh hưởng đến khả năng miễn dịch trong cộng đồng. Trong những năm gần đây, các loại thuốc kháng virus ức chế Neuraminidase ngày càng phát triển nhiều. Vì vậy, việc giám sát sự thay đổi gen/protein NA ngày càng được quan tâm.
So sánh sự tương đồng của các axit amin giữa các chủng lưu hành tại Việt Nam 2010-2012 với chủng dự tuyển vắc xin đại diện cho dòng B/Victoria (B/Brisbane/60/2008) và B/Yamagata (B/Wisconsin/01/2010) cho thấy một số vị trí axit amin thay đổi.
Bảng 3.10. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Vitoria, 2010-2012
Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi
34 41 125 204 210 220 320 329 358 B/Brisbane/60/2008.vac S S N V Y K D N E V1 2010 L P K I N E D A 2011 L P K I F N E D A 2012 L P K I F N K D A V2 2011 D 2012 D K
Kết quả phân tích trên protein NA thuộc dòng B/Vitoria cho thấy đã xác định được 36 axit amin thay đổi so với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008. Trong đó, có 9 axit amin thay đổi với tần xuất cao, xác định được ở phần lớn các chủng lưu hành tại Việt Nam năm 2010-2011 thuộc nhóm V1: S34L, S41P, N125K,, V204I, Y210F, K220N, D320E, N329D và E358A. Các đột biến này không thấy xuất hiện trong nhóm V2 lưu hành năm 2012 (chỉ xác định được 2/6 chủng năm 2012 và 1 chủng năm 2011 tại 1 vị trí N329D). Kết quả trên có thể thấy rằng sự thay đổi axit amin tại 9 vị trí này có thể là nguyên nhân phân tách giữa nhóm V1 và V2.
Bảng 3.11. Vị trí axit amin thay đổi trên protein NA dòng B/Yamagata, 2010- 2012
Chủng Năm Vị trí axit amin thay đổi
42 68 106 125 128 248 295 340
B/Wisconsin/01/2010.vac R T T K K I S N
Y1 2010 Q A I T V R D
2011 Q A I T R V R D
Tương tự như dòng B/Victoria, khi phân tích protein NA dòng B/Yamagata, các chủng virus trong nghiên cứu có 17 axit amin khác biệt so với chủng chuẩn B/Wisconsin/01/2010. Trong đó, có 8 axit amin xuất hiện với tần xuất cao, được xác định tại các virus lưu hành trong năm 2010-2011 thuộc nhóm Y1: R42Q, T68A, T106I, K125T, K128R, I248V, S295R và N340D. Số lượng chủng được giải trình tự năm 2012 là hạn chế nên trong nghiên cứu này, không xác định được chủng virus thuôc nhóm Y2.
Hình 3.19. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Victoria giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin
Hình 3.20. Số axit amin khác nhau trên protein NA dòng B/Yamagata giữa các chủng nghiên cứu và chủng dự tuyển vắc xin
Bảng 3.12. Số lượng trung bình axit amin thay đổi trên protein NA so với virus dự tuyển vắc xin của TCYTTG, 2010 -2012
Năm Virus dự tuyển vắc xin Số virus
(n) Phân nhóm Số aa thay đổi 2010 B/Brisbane/60/2008-like virus 3 V1 8,7 2011 B/Brisbane/60/2008-like virus 9 V1, V2 9,6 2012 B/Brisbane/60/2008-like virus (NBC) 7 V1,V2 4,9
Trong giai đoạn 2010- 2012, sự khác biệt trung bình về axit amin của các virus trong từng năm với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu) từ 4,9 đến 9,6 axit amin (bảng 3.12). Kết quả này gợi ý rằng virus cúm B/Victoria lưu hành tại Việt Nam đều có độ tương đồng cao với chủng virus vắc xin ở Nam Bán cầu.
Trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền gen HA và NA của virus cúm B, 2010-2012 tại Ningbo, Đông Nam Trung Quốc, virus lưu hành chủ yếu là dòng
thấy tất cả các chủng virus đều thuộc nhóm 1, nhóm có sự khác biệt từ 1-5 axit amin so với chủng vắc xin B/Brisbane/60/2008; trong khi đó gen NA được chia thành các nhóm khác nhau và có sự khác biệt về axit amin với chủng vắc xin là 6- 16 axit amin. Sự tiến hóa di truyền trên gen NA nhanh hơn trên gen HA [28]. Nghiên cứu về virus cúm B tại Hanan, Trung Quốc giai đoạn 2007-2010 cho thấy các virus dòng B/Victoria và B/Yamagata cũng được chia thành 2 nhóm: V1 (2007-2009) và V2 (2010); Y1 (2007) và Y2 (2009-2010). Khi phân tích gen NA của các chủng virus cho thấy tất cả gen NA đều thuộc dòng B/Yamagata. Điều này cho thấy các virus này đều có nguồn gốc B/Yamagata [34]. Điều tương tự này cũng đã được ghi nhân tại Italy khi phân tích các chủng cúm B mùa cúm 2002/2003 và 2003/2004 cho thấy có sư trao đổi và tích hợp giữa gen HA và NA: đó là các chủng virus HA/Victoria và NA/Yamagata [45].
*Các đột biến axit amin tại protein NA liên quan đến giảm độ nhạy/kháng thuốc của thuốc kháng virus Oseltamivir và Zanamivir
Protein NA đóng vai trò enzyme giúp giải phóng virus mới được tổng hợp ra khỏi tế bào nhiễm. Thuốc kháng virus được phát triển dựa trên cơ sở hoạt động ức chế hoạt động của enzyme neuraminidase này là Oseltamivir và Zanamivir. Một số đột biến được xác định liên quan đến khả năng làm giảm độ nhạy/kháng thuốc của virus cúm B được ghi nhận: D197N, I221T, S249G, H273Y, T325I và G407S (giảm độ nhạy với oseltamivir) [50, 54].
Hình 3.21. Các vị trí axit amin trên protein NA của 2 dòng B/Victoria và B/Yamagata liên quan đến đột biến kháng thuốc hoặc giảm độ nhạy của thuốc
Như vậy, việc sử dụng các loại thuốc kháng virus như oseltamivir và zanamivir có thể dẫn đến những đột biến thích nghi trên gen NA của virus cúm và có thể dẫn đến kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc điều trị. Vì vậy, việc kiểm soát phác đồ điều trị, giám sát sự kháng thuốc của virus cúm và nghiên cứu, phát triển thuốc mới trong điều trị bệnh cúm là điều rất cần thiết. Trong nghiên cứu của chúng tôi không phát hiện được đột biến axit amin tại các vị trí được cho là liên quan đến giảm độ nhạy/kháng thuốc oseltamivir và zanamivir. Kết quả này cho thấy việc điều trị bằng nhóm thuốc ức chế neuraminidase vẫn có hiệu quả tốt với virus cúm B.
Nghiên cứu trên thế giới giai đoạn 2004-2008 cũng đã ghi nhận những chủng virus cúm B kháng/giảm độ nhạy của thuốc tại Mỹ, Nhật Bản (B/Michigan/20/2005, B/California/4/2005…) (đột biến tại vị trí I221T, H273Y, T325I…)
KẾT LUẬN
1, Đặc tính di truyền ở các chủng virus cúm B lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2010-2012: lưu hành đồng thời 2 dòng kháng nguyên B/Vicroria (B/Victoria/2/87-lineage) và B/Yamagata (B/Yamagata/16/88-lineage), trong đó dòng B/Victoria chiếm ưu thế năm 2010, 2011 và dòng B/Yamagata chiếm ưu thế năm 2012.
- Dòng B/Victoria trên gen HA và NA đều được chia thành 2 nhóm V1 (2010-2011), cùng phân nhóm với chủng B/Brisbane/60/2008 và V2 (chủ yếu năm 2012) có độ tương đồng cao với các chủng lưu hành cùng thời gian tại Thái Lan và Trung Quốc.
- Dòng B/Yamagata trên gen HA và NA cũng được chia thành 2 nhóm: Y1 (2010-2012) có độ tương đồng cao với chủng vắc xin B/Florida/40/2006 và nhóm Y2 (2012) cùng nhóm với chủng vắc xin B/Wisconsin/01/2010.
- Sự tiến hóa giữa gen HA và NA của các virus cúm B, 2010-2012 dường như là giống nhau. Dòng B/Victoria dường như tiến hóa nhanh hơn so với dòng B/Yamagata ở cả hai gen HA và NA. Chỉ phát hiện duy nhất 1 chủng B/Viet Nam/LS62/2012 có gen HA thuộc nhóm V2, gen NA thuộc nhóm V1 nhưng tính kháng nguyên vẫn tương đồng với chủng B/Brisbane/60/2008.
2, Đặc tính kháng nguyên và các axit amin thay đổi liên quan đến sự thay đổi đặc tính kháng nguyên của virus cúm.
- Đặc tính kháng nguyên dòng B/Victoria các chủng virus lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có độ tương đồng với virus dự tuyển vắc xin B/Brisbane/60/2008 với hiệu giá HI ≥ 160 là 86,1% (62/72 chủng).
- Đặc tính kháng nguyên dòng B/Yamagata các chủng virus lưu hành tại miền Bắc Việt Nam có độ tương đồng với virus dự tuyển vắc xin
- Trên protein HA của các virus cúm B phát hiện sai khác từ 2,9 đến 4,0 axit amin so với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu) và 6,3 axit amin với virus vắc xin B/Wisconsin/1/2010 (Bắc Bán cầu).
- Trên protein NA của các virus cúm B phát hiện sai khác từ 4,9 đến 9,6 axit amin với virus vắc xin B/Brisbane/60/2008 (Nam Bán cầu).
- Không phát hiện đột biến liên quan đến sự giảm độ nhạy/kháng thuốc oseltamivir và zanamivir trên protein NA trên cả 2 dòng B/Victoria và B/Yamagata.
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi xin nêu một số kiến nghị như sau:
1, Tiếp tục giám sát sự tiến hóa về mặt di truyền học của virus cúm B để theo dõi sự thay đổi tính kháng nguyên liên quan đến khả năng bảo vệ của vắc xin tương thích giúp phòng ngừa và kiểm soát bệnh ở mức độ tốt nhất. Nên sử dụng vắc xin gồm 4 thành phần virus (H1N1, H3N2, B/Yamagata và B/Victoria- Quadrivalent Influenza Vaccine/QIV) để nâng cao hiệu quả bảo vệ của vắc xin cúm.
2, Tiếp tục giám sát chặt chẽ các đột biến axit amin liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy/kháng thuốc của thuốc kháng virus Oseltamivir và Zanamivir.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2002), Thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2001, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2003), Thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2002, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y tế (2004), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2003, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
4. Bộ Y tế (2005), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2004, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
5. Bộ Y tế (2006), Niên giám thống kê bệnh truyền nhiễm năm 2005, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
6. Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
7. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Lê Quỳnh Mai (2011), “Sự lưu hành của virut cúm mùa tại Hà Nội và miền Bắc Việt Nam, 2001-2008”, Tạp chí Y học Thực hành, 771, tr. 127-129.
8. Nguyễn Cơ Thạch (2010), Nghiên cứu sự tiến hóa về mặt di truyền học của virus cúm A/H3N2 tại miền Bắc Việt Nam, 2008-2010, Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
9. Phạm Văn Ty (2005), Vi rút học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
Tiếng Anh
10. Air, G M., and R. W. Compans (1983), “Influenza B and influenza C viruses. In P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetic of influenza viruses, p. 280-304, Springer-Verlag, New York.
11. Akçay Ciblak M., Kanturvardar Tütenyurd M., Asar S., Tulunoğlu M., Fındıkçı N., Badur S. (2012), “Influenza surveillance in nine consecutive seasons, 2003-2012: results from National Influenza Reference
Laboratory, Istanbul Faculty Of Medicine, Turkey”, Mikrobiyol Bul, 46(4), pp. 575-93.
12. Belshe RB, Coelingh K., Ambrose CS, Woo JC, Wu X. (2010), “Efficacy of live attenuated influenza vaccine in children against influenza B viruses by lineage and antigenic similarity”, Vaccine, 25,28(9), pp. 2149-56.
13. Belshe RB, M.P., Treanor J., King J., Gruber WC, et al. (1998), “The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenzavirus vaccine in children”, N Engl J Med, 338, pp. 1405-1412.
14. Brands R, V.J., Medema J., Palache AM, van Scharrenburg GJ (1999), “Influvac: a safe Madin Darby canine kidney (MDCK) cell culture-based influenza vaccine”,Dev Biol Stand, 98, pp. 93-100.
15. Buonagurio DA, S.N., JD Parvin, M. Krytal, P. Palese and WM Fitch (1986), “Evolution of human influenza A viruses over 50 years: rapid uniform rate of change in NS gene”,Science, 232, pp. 980-982.
16. CDC 1986- Centers for Disease Control (1986), “Toxic shock syndrome associated with influenza - Minnesota”, MMWR, 35, pp. 143-4.
17. Centers for Disease Control and Prevention (August 13-14, 2003),
Laboratory Techniques for Influenza Diagnosis, Surveillance Coordinator’s Conference Atlanta, Georgia, US.
18. Centers for Disease Control and Prevention (September 2010-August 2011), “Influenza-associated pediatric deaths - United States”, MMWR Morb Mortal Wkly Rep2011, 60, pp. 1233-8.
19. Chang - Sung Tung, Joshua L. Goodman, Henry Lu and Catherine A. Macken (2004), “Homology model of the structure of influenza B virus HA1”, Journal of General Virology, 85, pp. 3249-3259.
20. Christopher D. Paddock, Lindy Liu, Amy M. Denison, et al. (2012), “Myocardial Injury and Bacterial Pneumonia Contribute to the Pathogenesis of Fatal Influenza B Virus Infection”, JID, 205, pp. 895-905.
21. Feldman P, Cohanand M, Hierholzer W. (1972), “Fatal Hong Kong influenza: a clinical, microbiological and pathological analysis of nine