Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành, chiết cành, ghép cành.... Có ba phương thức tạo cây in vitro:
a. Hoạt hóa chồi nách
Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ bằng cách: (1) Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như cây thuốc lá, hoa cúc, ...); (2) Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy cây một lá mầm như lúa, mía...). Các chồi được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này được chuyển sang môi trường tạo rễ và được đưa ra vườn ươm khi có rễ hoàn chỉnh [15].
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: (1) Nhu cầu về loại và nồng độ cytokinin; (2) Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt động; (3) Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [3]. Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng rộng rãi ở nhiều loài thực vật. Quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ. Các cây mẹ cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch vi rút và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động. Đây là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy
in vitro. Các giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại
17
mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25- 27 oC, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000lux.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh bằng cách chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên. Cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp. Giá thể phải sạch đủ dinh dưỡng và độ ẩm, tơi xốp, thoát nước [5].
b. Tạo chồi bất định
Chồi bất định là chồi mọc ra từ các cơ quan, bộ phận khác của cây, không phải là phôi, ví dụ chồi hình thành từ mô sẹo (callus). Để tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành... Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo.
c. Tạo phôi vô tính
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Để tạo
18
phôi vô tính cần thực hiện hai quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua hai bước: (1) Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi; (2) Sự phát triển của phôi mới hình thành [15].
Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Vinh về cây
Stephania rotunda Lour cho thấy: Sau 1 tuần nuôi cấy mô sẹo từ khúc cắt thân, ở hầu hết các nghiệm thức, mẫu nuôi cấy đều xuất hiện mô sẹo tại những vết cắt ngang lóng thân. Trên các môi trường có NAA, mô sẹo hình thành ở dạng xốp có màu trắng đục rồi chuyển sang màu nâu sau 10 ngày. Trên môi trường có 2,4D, khối mô sẹo hình thành có trọng lượng tươi lớn, có màu xanh nhạt, không hoá nâu. Sự hình thành mô sẹo xảy ra rõ nhất trên nghiệm thức với nồng độ BAP 0,2 mg/l và 2,4-D 5 mg/l. Sau 1 tuần nuôi cấy, hầu hết các mẫu cấy đều có phản ứng tạo sẹo. Ở nghiệm thức NK1 (môi trường MS + 2,4-D 5 mg/l, BAP 0,2 mg/l) sau 3 tuần cấy, các mẫu tạo mô sẹo trắng, chắc có thể do hàm lượng khoáng thích hợp cho quá trình trao đổi chất ở tế bào, mô. Ở nghiệm thức NK2 (môi trường MS1/2 + 2,4-D 5 mg/l, BAP 0,2 mg/l) sẹo bị hóa nâu sau 2 tuần nuôi cấy, có thể do nồng độ khoáng của môi trường thấp dẫn đến ức chế quá trình trao đổi chất. Ở công thức NK3 chỉ có 39% mẫu tạo sẹo, sẹo tạo ít, xốp, có thể là do hàm lượng khoáng quá thấp, không thích hợp cho quá trình tạo sẹo. Sau 3 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức C6 (BAP 1 mg/l + NAA 0,2 mg/l) cho thấy chồi tạo thành nhiều nhất trong các nghiệm thức (3,3 chồi), có thể là do nồng độ auxin, cytokinin và tỉ lệ auxin/cytokinin thích hợp giúp kích thích sự tăng chồi non, tạo mới mô phân sinh chồi ngọn. Ở các nghiệm thức khác như C4 và C8 (BAP 3 mg/l) các chồi hình thành có hiện tượng hóa vàng và rụng lá sau 4 tuần. Điều này có thể do nồng độ hormon cao dẫn đến sự ức chế quá trình trao đổi chất của mô, tế bào làm mô chết. Từ đó có kết luận, khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt thân đạt hiệu quả cao trên môi trường MS bổ sung 2,4- Dx5 mg/l, BAP 0,2 mg/l. Môi trường có hàm lượng khoáng cao thích hợp cho
19
quá trình tạo mô sẹo từ khúc cắt thân. Trên môi trường MS bổ sung BAP 1,0 mg/l, NAA 0,2 mg/l, quá trình hình thành chồi từ chồi ngủ xảy ra thuận lợi. Ở tất cả các mẫu thí nghiệm (thân, củ và mô sẹo) đều có alkaloid rotundine. Trong đó mẫu củ chứa rotudin cao nhất [14].
20
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Một số mẫu cây Bình vôi hoa đầu thu thập tại Quảng Ninh, Bình vôi tím được thu thập tại Hà Giang.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Đề tài sử dụng các hóa chất như cồn, javen, axit benzoic, axit citric, thành phần môi trường MS cơ bản, sucrose, agar, than hoạt tính, các hóa chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin, ∞- NAA, IBA có nguồn gốc Việt Nạm, Trung Quốc, Mỹ, Đức…
2.1.2.2. Thiết bị
Các thiết bị chính dùng trong nghiên cứu gồm có: Nồi hấp khử trùng (Nhật Bản), tủ sấp (Đức), tủ lạnh (Nhật Bản), tủ cấy vô trùng (Indonesia), phòng nuôi cấy (phòng công nghệ tế bào, khoa Sinh học), cân điện tử (Đức). Các dụng cụ tiến hành các thí nghiệm: bình nuôi cấy, ống falcon, đũa thủy tinh…
Các mẫu được nuôi cấy trong trong điều kiện nhiệt độ 25 – 27°C và chế độ chiếu sáng 12h/12h với cường đô chiếu sáng là 2000 lux.
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau và có công thức đối chứng. Số mẫu nghiên cứu ở mỗi công thức lớn hơn hoặc bằng 30.
21
- Sử dụng môi trương MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm 30g/l đường sucrose, 8,5g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 200ml/l nước dừa trong 1 lít môi trường.
- Hóa chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, IBA ở các nồng độ khác nhau được bổ sung vào môi trường.
- Hấp khử trùng môi trường bằng nồi hấp TOMY (Nhật Bản) ở 121ºC trong 20 phút.
2.2.2. Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Vật liệu được sử dụng nhân giống cây Bình vôi là đoạn thân non, bánh tẻ. Đoạn thân non, bánh tẻ được cắt thành các khúc 2-3 cm có chứa chồi ngủ. Sau đó, rửa sạch đoạn thân dưới vòi nước máy và ngâm mẫu cấy trong dung dịch xà phòng. Sau 30 phút, mẫu được rửa sạch dưới vòi nước máy. Sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng bề mặt mẫu trong thời gian 3- 9 phút. Mẫu được rửa sạch từ 5-7 lần bằng nước cất khử trùng. Sau khi thấm khô mẫu trong điều kiện vô trùng, mẫu được cấy vào bình nuôi cấy môi trường MSo có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, nước dừa 200ml/l.
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro cây Bình vôi
2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và BAP với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l tương ứng với công thức môi trường NC1, NC2, NC3, NC4, NC5. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi/ mẫu:
Số chồi/ mẫu =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy
22
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%):
Kích thước chồi (cm): dùng thước đo
Màu sắc chồi
Màu sắc lá
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và kinetin với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l tương ứng với công thức môi trường Ki1, Ki2, Ki3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi/ mẫu:
Số chồi/ mẫu =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%):
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Số mẫu tạo chồi x 100% Tổng số mẫu nuôi cấy
Kích thước chồi (cm): dùng thước đo
Màu sắc chồi
Chiều dài cuống lá (cm)
Màu sắc lá
2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi
Các đoạn chồi ngọn có kích thước khoảng 2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước và NAA với nồng độ 0,3; 0,6; 0,9 mg/l tương ứng với công thức môi
Tỷ lệ mẫu tạo chồi =
Số mẫu tạo chồi
x 100 % Tổng số mẫu nuôi cấy
23
trường NAA1, NAA2, NAA3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số rễ/ chồi: Số rễ/ chồi = Tổng số rễ Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%): Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
Chất lượng rễ:
- Rễ ít và mảnh ký hiệu (-) - Rễ nhiều và mảnh ký hiệu (+) - Rễ nhiều và mập ký hiệu (++)
2.2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi
Các đoạn chồi ngọn có kích thước khoảng 2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và IBA với nồng độ 0,3; 0,6; 0,9 mg/l tương ứng với công thức môi trường IBA1, IBA2, IBA3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số rễ/ chồi: Số rễ/ chồi = Tổng số rễ Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%): Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
24
- Rễ ít và mảnh ký hiệu (-) - Rễ nhiều và mảnh ký hiệu (+) - Rễ nhiều và mập ký hiệu (++)
2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được cấy vào các công thức môi trường giống nhau về nồng độ, loại chất kích thích sinh trường và các phụ gia khác ngoại trừ than hoạt tính, bao gồm: công thức môi trường đối chứng (ĐC) không có than hoạt tính và công thức môi trường thực nghiệm (TN) có than hoạt tính với lượng than hoạt tính là 1g/l. Mỗi công thức được trực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi trên mô: Số chồi/ mô =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Số chồi trước nuôi cấy (chồi)
Tỷ lệ mô tạo chồi (%):
Tỷ lệ mô tạo chồi (%)= Tổng số chồi x100 Tổng số mô tạo chồi
Kích thước chồi (cm): dung thước đo
Màu sắc chồi
Chiều dài cuống lá (cm)
2.2.4. Phương pháp xử lý mẫu số liệu
Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, sẽ được tính toán bằng phần mềm Excel của Chu Văn Mẫn [12] các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X), sai số trung bình mẫu (mx).
25
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU
Muốn có cây non vô trùng, sạch bệnh để tiến hành các thí nghiệm sau này, đoạn thân non mang chồi ngủ được vô trùng trước khi đưa vào bình nuôi cấy (hình 3.1). Đề tài đã tiến hành khử trùng mẫu với thủy ngân ở các khoảng thời gian 3, 5, 7 và 9 phút. Bảng 3.1 cho thấy công thức khử trùng sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút là tối ưu nhất đối với đoạn thân non. Tỷ lệ bật chồi từ những chồi ngủ ở đoạn thân là 97,59%. Tuy nhiên một số mẫu bật chồi bị nhiễm nấm hoặc khuẩn (7,78 %) ở thời gian khử trùng 5 phút.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng cây Bình vôi tím từ đoạn thân non sau 4 tuần nuôi cấy
Thời gian xử lý Tỷ lệ mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn, chết (%) Tỷ lệ mẫu sạch sống sót (%) Tỷ lệ bật chồi (%) 3 phút 60 40 52,28 5 phút 7,78 92,22 97,59 7 phút 68,88 31,12 32,14 9 phút 87,78 12,22 9,09
Công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch sống sót là 92,22%; mẫu nhiễm nấm, khuẩn là 7,78%. Nguyên nhân làm cho các mẫu cấy bị nhiễm nấm có thể do thao tác khử trùng hoặc do mẫu cấy chưa đảm bảo. Khi xử lý mẫu cấy với HgCl2 trong 7 phút, tỷ lệ bật chồi (32,14%), tỷ lệ mẫu sạch sống sót thấp (31,12%), tỷ lệ mẫu bị nhiễm nấm, nhiễm khuẩn là 68,88 %. Khi xử lý mẫu bằng HgCl2 trong 9 phút, tỷ lệ bật chồi và tỷ lệ mẫu sạch sống sót thấp nhất (9,09% và 12,22%). Thời gian khử trùng kéo dài làm cho mẫu cấy bị thâm đen và chết, khả năng sống sót, tái sinh thấp và ảnh hưởng dẫn tới thời gian bật chồi kéo dài hơn. Dựa trên kết quả khử trùng
26
mẫu cây Bình vôi tím, chúng tôi sử dụng công thức khử trùng phù hợp nhất này cho các mẫu Bình vôi khác.
Hình 3.1. Chuẩn bị mẫu
(A) (B)
Hình 3.2. Mẫu cây Bình vôi tím tái sinh trong môi trường MS bổ sung nước dừa
(A: Sau 7 ngày nuôi cấy ; B: Sau 28 ngày nuôi cấy)
Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Thị Tình và cộng sự (2015), sử dụng đoạn thân non, bánh tẻ được cắt thành các khúc 2 - 3 cm, tiến hành ngâm trong dung dịch cồn 70% rồi khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian