Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Các chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau và có công thức đối chứng. Số mẫu nghiên cứu ở mỗi công thức lớn hơn hoặc bằng 30.
21
- Sử dụng môi trương MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thêm 30g/l đường sucrose, 8,5g/l agar, 1g/l than hoạt tính, 200ml/l nước dừa trong 1 lít môi trường.
- Hóa chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin, NAA, IBA ở các nồng độ khác nhau được bổ sung vào môi trường.
- Hấp khử trùng môi trường bằng nồi hấp TOMY (Nhật Bản) ở 121ºC trong 20 phút.
2.2.2. Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Vật liệu được sử dụng nhân giống cây Bình vôi là đoạn thân non, bánh tẻ. Đoạn thân non, bánh tẻ được cắt thành các khúc 2-3 cm có chứa chồi ngủ. Sau đó, rửa sạch đoạn thân dưới vòi nước máy và ngâm mẫu cấy trong dung dịch xà phòng. Sau 30 phút, mẫu được rửa sạch dưới vòi nước máy. Sử dụng dung dịch HgCl2 0,1% để khử trùng bề mặt mẫu trong thời gian 3- 9 phút. Mẫu được rửa sạch từ 5-7 lần bằng nước cất khử trùng. Sau khi thấm khô mẫu trong điều kiện vô trùng, mẫu được cấy vào bình nuôi cấy môi trường MSo có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, nước dừa 200ml/l.
2.2.3. Phương pháp nuôi cấy in vitro cây Bình vôi
2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và BAP với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l tương ứng với công thức môi trường NC1, NC2, NC3, NC4, NC5. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi/ mẫu:
Số chồi/ mẫu =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy
22
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%):
Kích thước chồi (cm): dùng thước đo
Màu sắc chồi
Màu sắc lá
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và kinetin với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l tương ứng với công thức môi trường Ki1, Ki2, Ki3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi/ mẫu:
Số chồi/ mẫu =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Tổng số mẫu nuôi cấy
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%):
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Số mẫu tạo chồi x 100% Tổng số mẫu nuôi cấy
Kích thước chồi (cm): dùng thước đo
Màu sắc chồi
Chiều dài cuống lá (cm)
Màu sắc lá
2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi
Các đoạn chồi ngọn có kích thước khoảng 2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước và NAA với nồng độ 0,3; 0,6; 0,9 mg/l tương ứng với công thức môi
Tỷ lệ mẫu tạo chồi =
Số mẫu tạo chồi
x 100 % Tổng số mẫu nuôi cấy
23
trường NAA1, NAA2, NAA3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số rễ/ chồi: Số rễ/ chồi = Tổng số rễ Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%): Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
Chất lượng rễ:
- Rễ ít và mảnh ký hiệu (-) - Rễ nhiều và mảnh ký hiệu (+) - Rễ nhiều và mập ký hiệu (++)
2.2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Bình vôi
Các đoạn chồi ngọn có kích thước khoảng 2 cm được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm đường sucrose 30g/l, agar 8,5 g/l, 200ml/l nước dừa và IBA với nồng độ 0,3; 0,6; 0,9 mg/l tương ứng với công thức môi trường IBA1, IBA2, IBA3. Mỗi công thức thực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số rễ/ chồi: Số rễ/ chồi = Tổng số rễ Tổng số chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%): Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
24
- Rễ ít và mảnh ký hiệu (-) - Rễ nhiều và mảnh ký hiệu (+) - Rễ nhiều và mập ký hiệu (++)
2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Bình vôi
Các đoạn thân mang mắt chồi bên có kích thước 1-2 cm được cấy vào các công thức môi trường giống nhau về nồng độ, loại chất kích thích sinh trường và các phụ gia khác ngoại trừ than hoạt tính, bao gồm: công thức môi trường đối chứng (ĐC) không có than hoạt tính và công thức môi trường thực nghiệm (TN) có than hoạt tính với lượng than hoạt tính là 1g/l. Mỗi công thức được trực hiện trên 30 mẫu, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Chỉ tiêu theo dõi gồm:
Số chồi trên mô: Số chồi/ mô =
Số chồi sau nuôi cấy (chồi) Số chồi trước nuôi cấy (chồi)
Tỷ lệ mô tạo chồi (%):
Tỷ lệ mô tạo chồi (%)= Tổng số chồi x100 Tổng số mô tạo chồi
Kích thước chồi (cm): dung thước đo
Màu sắc chồi
Chiều dài cuống lá (cm)
2.2.4. Phương pháp xử lý mẫu số liệu
Sau khi tiến hành nuôi cấy và thu thập số liệu, sẽ được tính toán bằng phần mềm Excel của Chu Văn Mẫn [12] các giá trị thống kê về giá trị trung bình (X), sai số trung bình mẫu (mx).
25
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG MẪU
Muốn có cây non vô trùng, sạch bệnh để tiến hành các thí nghiệm sau này, đoạn thân non mang chồi ngủ được vô trùng trước khi đưa vào bình nuôi cấy (hình 3.1). Đề tài đã tiến hành khử trùng mẫu với thủy ngân ở các khoảng thời gian 3, 5, 7 và 9 phút. Bảng 3.1 cho thấy công thức khử trùng sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút là tối ưu nhất đối với đoạn thân non. Tỷ lệ bật chồi từ những chồi ngủ ở đoạn thân là 97,59%. Tuy nhiên một số mẫu bật chồi bị nhiễm nấm hoặc khuẩn (7,78 %) ở thời gian khử trùng 5 phút.
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng cây Bình vôi tím từ đoạn thân non sau 4 tuần nuôi cấy
Thời gian xử lý Tỷ lệ mẫu bị nhiễm nấm, khuẩn, chết (%) Tỷ lệ mẫu sạch sống sót (%) Tỷ lệ bật chồi (%) 3 phút 60 40 52,28 5 phút 7,78 92,22 97,59 7 phút 68,88 31,12 32,14 9 phút 87,78 12,22 9,09
Công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch sống sót là 92,22%; mẫu nhiễm nấm, khuẩn là 7,78%. Nguyên nhân làm cho các mẫu cấy bị nhiễm nấm có thể do thao tác khử trùng hoặc do mẫu cấy chưa đảm bảo. Khi xử lý mẫu cấy với HgCl2 trong 7 phút, tỷ lệ bật chồi (32,14%), tỷ lệ mẫu sạch sống sót thấp (31,12%), tỷ lệ mẫu bị nhiễm nấm, nhiễm khuẩn là 68,88 %. Khi xử lý mẫu bằng HgCl2 trong 9 phút, tỷ lệ bật chồi và tỷ lệ mẫu sạch sống sót thấp nhất (9,09% và 12,22%). Thời gian khử trùng kéo dài làm cho mẫu cấy bị thâm đen và chết, khả năng sống sót, tái sinh thấp và ảnh hưởng dẫn tới thời gian bật chồi kéo dài hơn. Dựa trên kết quả khử trùng
26
mẫu cây Bình vôi tím, chúng tôi sử dụng công thức khử trùng phù hợp nhất này cho các mẫu Bình vôi khác.
Hình 3.1. Chuẩn bị mẫu
(A) (B)
Hình 3.2. Mẫu cây Bình vôi tím tái sinh trong môi trường MS bổ sung nước dừa
(A: Sau 7 ngày nuôi cấy ; B: Sau 28 ngày nuôi cấy)
Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Thị Tình và cộng sự (2015), sử dụng đoạn thân non, bánh tẻ được cắt thành các khúc 2 - 3 cm, tiến hành ngâm trong dung dịch cồn 70% rồi khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao không nhiễm đạt 68,89%. Mẫu sau khi khử trùng cho tỷ lệ tái sinh cao nhất trong môi trường MS cải tiến đạt tỷ lệ tái sinh 88,89% sau 4 tuần nuôi cấy [20]. Như vậy, khả năng tái sinh không nhiễm khi sử dụng dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cao hơn thí nghiệm của Ngô Thị Tình và cộng sự là 23,33% và tỷ lệ tái sinh cao hơn 8,7%, nhưng thời gian lại ngắn hơn và không sử dụng cồn 70%. Nguyên nhân dẫn đến sai khác này có thể do
27
hóa chất và cách xử lý mẫu. Cồn thường là tác nhân gây tổn thương, phá hủy diệp lục trong các mô lá, thân non. Do vậy, các mẫu được xử lý bằng cồn thường bị thâm, đen và chết sau một tuần nuôi cấy.
3.2. NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY IN VITRO CÂY BÌNH VÔI HOA ĐẦU HOA ĐẦU
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin đến sự tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu vôi hoa đầu
Trong môi trường nghiên cứu in vitro, khi bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như auxin, cytokinin, gibberellin sẽ kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa của các cơ quan, từ đó tạo nên sự sinh trưởng, phát triển tốt cho các mô và tổ chức. Tuy nhiên, mỗi loài thực vật lại thích hợp với một loại và một nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Vì vậy, việc tìm ra công thức môi trường với nồng độ và chất kích thích thích hợp với từng loài cây, từng giai đoạn phát triển là bước quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro.
3.2.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu đầu
BAP (6-benzyl Amino Purin) là hormone thuộc nhóm cytokinin. Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của adenin, có ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin có vai trò quan trọng trong tạo đa chồi của mẫu nuôi cấy. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu được thực hiện trên 3 công thức môi trường với nồng độ BAP khác nhau như Bảng 3.2, và so sánh với mẫu trong môi trường đối chứng (ĐC).
Các mẫu cấy được theo dõi và lấy số liệu theo các chỉ tiêu: Số chồi/mô, chiều dài chồi, chiều dài cuống lá, màu sắc lá, màu sắc chồi. Các số liệu được lấy định kỳ
28
sau 3 tuần, 5 tuần và 7 tuần để đánh giá khả năng tạo chồi cũng như tình trạng mẫu cấy ở mỗi môi trường nghiên cứu và được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu
Công thức môi trường Nồng độ BAP (mg/l) Tỷ lệ mô tạo chồi (%) Số chồi/mô Chiều cao chồi (cm) Chiều dài lá (cm) Sau 3 tuần ĐC 0 100 1,03 ± 0,03 0,77 ± 0,12 1,50 ± 0,11 NC1 0,5 100 1,16 ± 0,07 0,43 ± 0,04 1,17 ± 0,06 NC2 1,0 100 1,67 ± 0,14 0,72 ± 0,05 0,92 ± 0,05 NC3 1,5 100 1,07 ± 0,05 0,43 ± 0,04 1,00 ± 0,11 Sau 5 tuần ĐC 0 100 1,18 ± 0,08 0,89 ± 0,11 1,75 ± 0,13 NC1 0,5 100 1,33 ± 0,14 0,55 ± 0,04 1,41 ± 0,06 NC2 1,0 100 1,70 ± 0,14 0,95 ± 0,05 1,19 ± 0,05 NC3 1,5 100 1,21 ± 0,12 0,60 ± 0,06 1,16 ± 0,1 Sau 7 tuần ĐC 0 100 1,21 ± 0,08 1,16 ± 0,12 2,30 ± 0,18 NC1 0,5 100 1,44 ± 0,15 0,84 ± 0,04 2,00 ± 0,29 NC2 1,0 100 1,74 ± 0,15 1,07 ± 0,05 1,56 ± 0,06 NC3 1,5 100 1,43 ± 0,13 0,72 ± 0,06 1,30 ± 0,11 Kết quả Bảng 3.2 cho thấy, ở mỗi công thức nghiên cứu ĐC, NC1, NC2, NC3 đều cho tỷ lệ mô tạo chồi là 100%. Tỷ lệ số chồi/mô ở các môi trưởng có bổ sung BAP đều cao hơn môi trường đối chứng (ĐC) cho thấy khả năng tạo chồi cao hơn khi có chất kích thích BAP. Trong đó, công thức môi trường NC2 với nồng độ BAP 1mg/l cho tỷ lệ số chồi/mô cao nhất và liên tục trong 3 lần lấy số liệu: sau 3 tuần là
29
1,67; sau 5 tuần là 1,7; sau 7 tuần là 1,74. Các chỉ tiêu còn lại như: Chiều cao chồi, chiều dài cuống lá cho thấy mẫu cây sinh trưởng bình thường.
Qua quan sát thấy rằng, màu sắc lá của một số mẫu ở công thức NC3 chuyển sang màu vàng từ tuần 5, sinh trưởng của cây bị ức chế. Như vậy, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, nồng độ BAP 1,0 mg/l là có hiệu quả cao nhất trong việc tạo đa chồi bằng BAP đối với cây Bình vôi hoa đầu.
Hình 3.3. Chồi cây Bình vôi hoa đầu trên môi trường NC2
3.2.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu hoa đầu
Tương tự như với BAP, các mẫu đoạn thân cây Bình vôi được chúng tôi cấy vào các công thức môi trường có bổ sung kinetin với các nồng độ khác nhau và môi trường đối chứng như trong Bảng 3.3, mỗi công thức được nghiên cứu trên 30 mẫu Bình vôi hoa đầu. Các chỉ tiêu theo dõi được đo và ghi định kỳ vào tuần 2, tuần 4 và tuần 6. Kết quả theo dõi được khái quát trong Bảng 3.3.
Kết quả Bảng 3.3 cho thấy với các nồng độ kinetin được nghiên cứu đều cho tỷ lệ mô tạo chồi là 100%, tỷ lệ số chồi/mô đều cao hơn ở môi trường đối chứng. Trong đó, công thức môi trường Ki1 với nồng độ kinetin là 0,5 mg/l cho tỷ lệ số chồi/mô cao nhất liên tục trong các lần đo: 1,34 ở tuần 3; 1,41 ở tuần 5; 1,41 ở tuần 7. Chiều dài cuống lá, màu sắc lá và máu sắc thân ở công thức môi trường Ki1 cho
30
thấy các mẫu mô sinh trưởng tốt. Một số mẫu mô ở công thức môi trường Ki2 và Ki3 có hiện tượng lá chuyển màu vàng, màu sắc chồi chuyển màu vàng ở tuần 7.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo chồi cây Bình vôi hoa đầu
Công thức môi trường
Nồng độ Kinetin (mg/l)
Tỷ lệ mô tạo
chồi (%) Số chồi/ mô
Chiều cao chồi (cm) Chiều dài lá (cm) Sau 3 tuần ĐC 0 100 1,03 ± 0,03 0,77 ± 0,12 1,50 ± 0,11 Ki1 0,5 100 1,34 ± 0,10 0,56 ± 0,06 0,94 ± 0,09 Ki2 1,0 100 1,25 ± 0,08 0,52 ± 0,05 0,82 ± 0,09 Ki3 1,5 100 1,23 ± 0,08 0,44 ± 0,03 0,98 ± 0,09 Sau 5 tuần ĐC 0 100 1,18 ± 0,08 0,89 ± 0,11 1,75 ± 0,13 Ki1 0,5 100 1,41 ± 0,11 0,60 ± 0,05 1,30 ± 0,13 Ki2 1,0 100 1,28 ± 0,08 0,63 ± 0,06 1,12 ± 0,19 Ki3 1,5 100 1,25 ± 0,09 0,51 ± 0,04 1,10 ± 0,12 Sau 7 tuần ĐC 0 100 1,21 ± 0,08 1,16 ± 0,12 2,30 ± 0,18 Ki1 0,5 100 1,41 ± 0,11 0,71 ± 0,06 1,79 ± 0,18 Ki2 1,0 100 1,34 ± 0,10 0,74 ± 0,05 1,57 ± 0,23 Ki3 1,5 100 1,33 ± 0,10 0,57 ± 0,04 1,49 ± 0,13 Hình 3.4.
31
Từ kết quả Bảng 3.3 và Hình 3.4 cho thấy, trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, nồng độ kinetin 0,5 mg/l là có hiệu quả nhất trong việc tạo đa chồi cây Bình vôi hoa đầu bằng kinetin.
3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ ở cây Bình vôi hoa đầu
Kích thích tạo rễ là khâu cuối cùng của giai đoạn nghiên cứu in vitro nhằm tạo ra cây hoàn chỉnh. Các chất kích thích NAA, IBA đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia tế bào và hình thành rễ. Do đó chúng tôi thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng