4. Ý nghĩa khoa học
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway
Gateway
Kỹ thuật Gateway là một phƣơng pháp nhân dòng phổ biến và tiện ích dựa trên cơ sở phản ứng tái tổ hợp đặc hiệu vị trí giữa các điểm chuyên biệt ở DNA của phage và vi khuẩn đƣợc gọi là các điểm gắn (attachment sites). Với kỹ thuật này, một hoặc nhiều gen đích có thể di chuyển từ entry clone vào bất kì vector đích biểu hiện nào theo đúng chiều và khung đọc chỉ trong một bƣớc thao tác mà không phải sử dụng bất kỳ enzyme cắt giới hạn nào. pK7WG2D là một vector thuộc hệ thống Gateway với cấu trúc gồm 1 vùng chứa cassette attR1- ccdB-attR2. Vì vậy, sản phẩm của phản ứng LR là một plasmid có chứa 1 vị trí tái tổ hợp mang gen đích có chiều mong muốn.
Thành phần và các bƣớc thực hiện phản ứng LR đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ Kit Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix của Invitrogen với vector đích là pK7WG2D và entry clone chính là vector pENTR/SSIV đã thiết kế thành công. Sản phẩm của phản ứng đƣợc sử dụng để biến nạp vào tế bào khả biến E.
coli One Shot TOP10 và chọn lọc trên môi trƣờng có bổ sung Spectinomycin 100
µg/ml. Để sàng lọc các dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV mong muốn, chúng tôi thực hiện phản ứng colony-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F và SSIV-Frag_R khuếch đại một đoạn ngắn gần 1 kb của gen SSIV. Các dòng khuẩn lạc cho kết quả PCR dƣơng tính sẽ đƣợc chọn để nuôi cấy và tiến hành tách chiết plasmid, sau đó cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn EcoRI.
Hình 8. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra
sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI.
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt cho thấy chúng tôi đã chọn đƣợc các dòng plasmid tái tổ hợp pK7WG2D/SSIV cho các băng DNA đúng kích thƣớc theo tính toán lý thuyết là: 10661 bp, 2201 bp và 1486 bp, chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector pK7WG2D/SSIV.