4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.2.3. Phân tích sinh học phân tử
Phân tích sinh học phân tử được thực hiện với sự hỗ trợ kỹ thuật của CN. Ngô Thị Hạnh dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Lê Đức Minh (Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội).
Mẫu cơ của các loài rắn được thu thập trong các chuyến khảo sát thực địa được bảo quản trong cồn 70% (Merk, Đức) ở -4oC. Tách chiết DNA tổng số sử dụng bộ kit Dneasy Blood & Tissue (Qiagen, Đức). Quá trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng PCR được tiến hành sử dụng HotStar Taq Mastermix (Qiagen, Đức) với những mẫu có nồng độ DNA thấp và DreamTaq Mastermix (ThermoFisher Scienctific, Lithuania) với những mẫu có nồng độ DNA cao. Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây Guo và cs. (2013) [30], Siler và cs. (2013) [57], Grismer và cs. (2014) [28], học viên chọn đoạn gen Cyt-b để giải trình tự và so sánh với các trình tự đã công bố trên ngân hàng gen (Genbank). Mồi sử dụng cho nghiên cứu này được tổng hợp theo Burbrink và cs. (2000) [15].
Bảng 2.3. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Lycodon
Tên mồi Trình tự mồi
L14910 5’-GACCTGTGATMTGAAAACCAYCGTTGT-3’ H16064 5’-CTTTGGTTTACAAGAACAATGCTTTA-3’
Tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 20-21µl, bao gồm 10µl mastermix, 5µl nước, 2µl mỗi chiều mồi, 1-2µl DNA khuôn, tùy thuộc vào nồng độ DNA. Điều kiện phản ứng PCR: 95C ở 15’ đối với HotStarTaq mastermix và 5’ đối với DreamTaq mastermix; 35 chu kỳ phản ứng ở 95oC trong 30s, 480C trong 45s, 72oC trong 60s; bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 6 phút. Đối chứng âm được sử dụng trong mỗi lần tách chiết cũng như mỗi lần PCR. Sản phẩm PCR thành công sau đó được tinh sạch sử dụng kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher Scientific, Lithuania) và gửi giải trình tự hai chiều ở FirstBase (Ma-lai-xi-a). Cuối cùng, kết quả giải trình tự được xác thực bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng gen.
Các trình tự thu nhận được từ nghiên cứu này cùng với các trình tự sẵn trên Ngân hàng gen (Genbank) được gióng cột bằng phần mềm ClustalX (Thompson và cs. 1997) với các lựa chọn mặc định cho chức năng sắp xếp hoàn chỉnh [63]. Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựa trên phương pháp Baysian sử dụng phần mềm MrBayes v3.2 (Ronquist và cs. 2012), mô hình tiến hóa tối ưu được xác định bằng phần mềm Modeltest v3.7 (Posada và cs. 1998) với các thông số khác được phần mềm MrBayes v3.2 xác định [54], [56]. Các phân tích được thực hiện dựa trên cây ngẫu nhiên lúc ban đầu và chạy trong 1×107 thế hệ, lấy mẫu sau 1000 thế hệ. Giá trị của gốc nhánh được coi là đáng tin cậy khi xác suất hậu nghiệm ≥ 95%. Việc ước tính khoảng cách di truyền giữa các mẫu được thực hiện trên phần mềm PAUP v4.0b10 (Swofford & Sunderland 2001) [61].