A/H5N1.
2.3.5.1. Nguyên lý
Kháng thể đơn dịng kháng ovalbumin từ chuột sẽ bắt kháng nguyên ovalbumin đã liên kết với kháng thể trước đĩ tạo thành phức hệ kháng thể - kháng nguyên - kháng thể (KT-KN-KT). Cộng hợp kháng IgG chuột gắn biotin được thêm vào sẽ gắn với kháng thể đơn dịng kháng ovalbumin từ chuột. Sau khi cho tiếp cộng hợp Streptavidin Horseradish peroxidase (Streptavidin-PO) vào nĩ sẽ liên kết với cộng hợp kháng IgG chuột gắn biotin. Cơ chất thêm vào xảy ra phản ứng chuyển màu. Dừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 2M và dựa vào cường độ màu
đểđịnh lượng hàm lượng ovalbumin cĩ trong mẫu.
2.3.5.2. Các bước tiến hành
Gắn kháng thể kháng ovalbumin vào phiến ELISA
- Huyết thanh kháng ovalbumin tinh chế
- Pha lỗng kháng thể trong đệm carbonate pH 9,6
- Cho 100 µl kháng thể đã pha lỗng vào tất cả các giếng của phiến nhựa ELISA, ủ qua đêm ở 37oC.
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa 0,05% Tween 20 và khĩa phiến bằng
- Ủở 37oC, sau đĩ rửa 4 lần bằng dung dịch rửa.
Ủ với kháng nguyên ovalbumin
- Cho vào tất cả cả giếng 100 µl đệm pha kháng nguyên ovalbumin.
- Cho 100 µl ovalbumin chuẩn 20µg/ml và các mẫu thử ovalbumin vào các giếng ở hai cột đầu tiên.
- Tiến hành pha lỗng bậc hai từ cột 2 đến cột thứ 11, cột 12 dùng làm chứng âm.
- Đậy phiến bằng băng keo, ủ 37oC trong một giờ.
Bắt phức hệ KT-KN bằng kháng thể đơn dịng kháng ovalbumin từ chuột
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa.
- Pha kháng thể đơn dịng kháng ovalbumin từ chuột thành nồng độ 1/5000 trong dung dịch đệm pha kháng thể.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl kháng thểđơn dịng đã pha lỗng.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC/1 giờ.
Cho cộng hợp kháng chuột gắn biotin
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dich rửa.
- Pha cộng hợp IgG kháng chuột gắn biotin thành nồng độ 1/2000 trong dung dịch đệm pha kháng thể.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl cộng hợp kháng chuột gắn biotin đã pha lỗng.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC trong 1 giờ.
Cho Streptavidine-PO kết hợp biotin trên pha rắn
- Rửa phiến 4 lần bằng dung dịch rửa.
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch Streptavidin-PO pha lỗng 1/5000 pha trong dung dich đệm pha kháng thể.
- Đậy phiến bằng băng keo và ủ 37oC trong 1 giờ.
Hiện màu và tính kết quả
- Cho vào tất cả các giếng 100 µl dung dịch cơ chất đã pha lỗng trong đệm pha cơ chất.
- Sau 10÷15 phút phản ứng hiện màu. Dừng phản ứng bằng 50 µl H2SO4
2M/giếng.
Đo mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA-Titertek Multiskal MCC/344 ở
bước sĩng 450nm. Tính kết quả bằng phần mềm Kinetic calculator V2.03 (Bio- Tek Instruments) và vẽđồ thị (hình 2.3)