3.4. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
3.4.2. Kết quả xác định độ nhạy của phản ứng
Cĩ hai đại lượng đại diện cho độ nhạy của phản ứng là giới hạn phát hiện (Limit of Detection: LOD) và giới hạn định lượng (Limit of Quantitation: LOQ).
LOD là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu cịn cĩ thể phát hiện
được mà khơng nhất thiết phải xác định chính xác hàm lượng. Thường việc xác
định giới hạn phát hiện bằng cách tìm xem chất cần thử cĩ nồng độ cao hơn hay thấp hơn một giới hạn nào đĩ. LOQ là lượng thấp nhất của chất cần thử cĩ trong mẫu thử cịn cĩ thể xác định được với mức độ đúng và chính xác thích hợp. Giới hạn định lượng là một thơng số của phương pháp định lượng đối với lượng thấp nhất của chất cần thử cĩ trong khung mẫu và được sử dụng đặc biệt trong việc xác
định các tạp chất và các sản phẩm phân hủy. Trong phản ứng ELISA cĩ thể căn cứ
trên mật độ quang của mẫu trắng (mật độ quang nền) tính được hai giá trị này theo cơng thức [10]:
LOD= OD nền trung bình + 3SD (độ lệch chuẩn) LOQ= OD nền trung bình + 10SD
Trong đĩ, SD (Standard deviation) là độ lệch chuẩn của phản ứng. Độ lệch chuẩn của phản ứng càng thấp thì LOD, LOQ càng cĩ độ chính xác cao hay độ
chính xác của phản ứng càng cao.
Cách xác định: với cùng một mẫu đã được làm đồng nhất, tiến hành xác
định bằng phương pháp đề xuất nhiều lần n lần (n= 6÷10 hay nhiều hơn…), sau đĩ áp dụng cơng thức:
SD = ( ) 1 2 − − ∑ n X Xi
Trong đĩ: xi là giá trịđo được thứ i X là giá trị trung bình n là số lần đo
Xác định độ nhạy của phương pháp là tìm nồng độ ovalbumin thấp nhất cĩ trong mẫu thử cịn cĩ thể phát hiện được và xác định chính xác nồng độ ovalbumin cĩ trong mẫu thử, sau khi tiến hành pha lỗng ovalbumin thành nhiều độ pha khác nhau.
Bảng 3.4. Độ nhạy của phản ứng (LOD và LOQ)
n OD nền trung bình SD Độ nhạy LOD LOQ OD Nồng độ ovalbumin (ng/ml) OD Nồng độ ovalbumin (ng/ml) 24 0,078 0,014 0,102 30 0,173 60
Từ bảng 3.4 ta thấy, LOD của phản ứng cĩ mật độ quang là 0,102 và LOQ cĩ mật độ quang là 0,173 tương ứng với nồng độ ovalbumin lần lượt là 30ng/ml và 60ng/ml. Như vậy, đối với mẫu thử cĩ nồng độ ovalbumin ≥ 30ng/ml thì phương pháp ELISA phát hiện được với mức độđịnh tính. Ở nồng độ ovalbumin ≥ 60ng/ml cĩ trong mẫu thử sẽ được xác định ở mức độ định lượng trong phương pháp này. Kết quả này cho thấy, hệ ELISA được xây dựng trong nghiên cứu này cĩ khả năng phát hiện ovalbumin với khoảng nồng độ tương đương với bộ kít ELISA định lượng ovalbumin của hãng Alpha Diagnostic International (1ng đến 20ng).
Bên cạnh đĩ, tiêu chuẩn của hàm lượng ovalbumin trong vacxin cúm cho phép là nhỏ hơn 1 µg/ml. Trong khi đĩ, phương pháp này cĩ thể định lượng được 60ng/ml nhỏ hơn 16 lần so với mức yêu cầu. Chính vì thế, phương pháp này cĩ thể định lượng với các mẫu cĩ hàm lượng ovalbumin thấp và cho độ chính xác cao. Do
đĩ, phương pháp này đạt yêu cầu trong phát hiện và định lượng ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1.
Như vậy, hệ ELISA xây dựng theo phương pháp này đạt tiêu chuẩn xác định nồng độ ovalbumin trong vacxin cúm A/H5N1 theo mục tiêu đã đề ra.