đông khô
Lactobacillus là một chi vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí, hình que và không hình thành bào tử [56]. Chính vì đặc điểm không hình thành bào tử nên chúng ta không thể bảo quản Lactobacillus bằng phương pháp sấy khô vì chúng rất dễ chết dưới nhiệt độ cao. Do vậy, tại Việt Nam các sản phẩm probiotics nghiên cứu cho phụ nữ hầu hết đều chuyển sang chi Bacillus vì đặc điểm của chi này là có hình thành bào tử và chúng không bị chết sau quá trình sấy khô [98]. Đây cũng là một trong các lý do khiến chúng tôi thực hiện nghiên cứu này.
Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số vi rút và được chúng tôi sử dụng để bảo quản chế phẩm probiotics có chứa Lactobacillus spp. [6].
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.1.1. Nguyên liệu
60 mẫu sữa mẹ được thu thập từ các bà mẹ sống ở cả nông thôn (30 mẫu) và thành thị (30 mẫu) tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam.
Các chủng vi sinh vật kiểm định: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, C. albicans JCM 2070 (Được lưu giữ ở 4oC tại Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống).
Chủng vi sinh vật đối chứng: L. reuteri VTCC 910087 (Được lưu giữ ở 4oC tại Green Lab - Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống).
Các hóa chất khác như thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kit tinh sạch DNA và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này được sản xuất từ các hãng có uy tín về sinh học phân tử như Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Mỹ), Thermo Scientific (Mỹ), Anabio R&D (Việt Nam), ...
2.1.2. Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ
Các mẫu sữa cho nghiên cứu được thu thập từ những bà mẹ cho con bú khỏe mạnh không sử dụng kháng sinh trong vòng 2 tuần trước đó. Các bà mẹ tình nguyện đồng ý tham gia nghiên cứu này được kí vào bản thỏa thuận (Consent form – Phụ lục 1) và được yêu cầu tránh ăn uống bất kỳ thực phẩm nào bổ sung thêm vi khuẩn axit lactic trong 2 tuần trước khi thu thập mẫu sữa. Thu thập mẫu sữa từ những bà mẹ trong độ tuổi từ 16 đến 30 và các mẫu sữa được thu thập sau khoảng 0 - 6 ngày tính cả thời vận chuyển. Các bà mẹ được yêu cầu không cho con bú trong vòng 1 đến 2 giờ trước khi lấy mẫu sữa và lấy mẫu vào buổi sáng. Mẫu sữa được thu thập và được làm sạch bề mặt vú & núm vú mà không cần sát trùng trước khi lấy mẫu. Trong mỗi trường hợp, sữa mẹ được thu thập vô trùng bằng máy hút sữa, 10 - 15 mL sữa đầu tiên được thu thập và chuyển vào ống falcon vô trùng. Các mẫu sữa mẹ sau đó được đông lạnh ngay lập tức và được lưu trữ ở -20oC trong tối đa 1 tháng. Các mẫu được đóng gói với đá khô trong hộp cách nhiệt và được gửi đến phòng thí nghiệm của chúng tôi nếu ở xa. Mẫu sữa đông lạnh được rã đông qua đêm trong tủ lạnh và sau đó duy trì ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi được pha loãng và cấy trải [91].
2.1.3. Thiết bị
- Máy lắc ổn nhiệt (Model: WSB – 30; Serial No: 0398272117PO10; Hàn Quốc); - Bình khí N2 và dây dẫn khí (Model: Tornado LS/B – He; Việt Nam);
- Cân điện tử (Model: precisa 310M, Thụy Sĩ);
- Box cấy kị khí (Model: Whitley VA 500 workstation, Anh); - Máy PCR (Mastercycler, Eppendorf, Đức);
- Hệ thống điện di gel agarose (NixTechnik, Pháp); - Kính hiển vi quang học Olimpus (Nhật);
- Máy đo OD (Model: Biomate 3; Serial No: 2KBK 138001; Mỹ);
- Máy đông khô (Modulyod Freeze Dryer, Thermo electron corporation); - Tủ ấm 37oC.
2.1.4. Dụng cụ
Pipet, đầu côn, đĩa Petri, ống falcol, ống eppendorf, bình tam giác, ống đong, ống nghiệm, bình lên men,…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp. trongmẫu sữa mẹ mẫu sữa mẹ
2.2.1.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. trong mẫu sữa mẹ
Xác định tổng số Lactobacilli (CFU/mL) xuất hiện trong mỗi mẫu sữa theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): mỗi mẫu sữa được pha loãng 10 lần trong dung dịch NaCl 0,15 M. Sau đó cấy trải 100 µL mẫu từ mỗi nồng độ pha loãng lên trên đĩa thạch MRS và đĩa thạch LBS. Các đĩa thạch này sau đó được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC dưới điều kiện kị khí [91]. Thành phần môi trường MRS và LBS được liệt kê dưới đây:
- Môi trường thạch MRS
Thành phần Khối lượng hoặc thể tích
Đường 20 g/L Pepton 10 g/L Cao nấm men 5 g/L Cao thịt 5 g/L K2HPO4.3H3O 2 g/L Tween 80 1 mL/L MgSO4.7H2O 0,2 g/L MnSO4 0,05 g/L CH3COONa 5 g/L CaCO3 10 g/L Agar 15 g/L H2O 1 lít
- Môi trường MRS lỏng không có CaCO3 và agar.
Chuẩn pH 6,2 – 6,5. Khử trùng ướt môi trường 110oC trong 20 phút.
- Môi trường LBS
Thành phần Khối lượng/Thể tích (gam/lít)
Casein enzymic hydrolysate 10,0
Yeast extract 5,0
Dextrose 20,0
Sodium acetate 25,0 Monopotassium hydrogen phosphate 6,0
Ammonium citrate 2,0 Polysorbate 80 1,0 Magnesium sulphate 0,575 Manganese sulphate 0,12 Ferrous sulphate 0,034 Agar 15,0
Chuẩn pH 5.5 ± 0.2 (ở 25 oC). Khử trùng ướt môi trường 121oC trong 15 phút. Làm giàu môi trường để tăng sinh L. reuteri trong các mẫu sữa mẹ theo phương pháp của Sinkiewicz và Ljunggren (2008): Cứ 1 mL sữa mẹ đã voltex đều được thêm vào 10 mL môi trường (bao gồm 20 mM arabinose; 20 mM ribose; 1 mM MgSO4; 0,1 mM MnSO4; 5 mM FeSO4). Hỗn hợp làm giàu được ủ ở 37oC trong 6 đến 8 giờ. Các mẫu sữa mẹ sau khi làm giàu được cấy trải trên môi trường thạch MRS cải tiến chứa 0,05 mg/mL vancomycin để xác định sự có mặt của L. reuteri. Các đĩa thạch được ủ trong 48 - 72 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí [91]. Các khuẩn lạc L. reuteri được xác định và đếm bằng cách sử dụng phương pháp của Chung và đồng tác giả (1989) dựa trên việc sản xuất reuterin đặc trưng của L. reuteri từ glycerol trong điều kiện kị khí tại 37oC và pH 6-8 [24].
Các chủng Lactobacillus spp. sau phân lập được thử hoạt tính sơ bộ về khả năng sinh axit lactic và sau đó tuyển chọn ra các chủng có khả năng sinh axit lactic cao nhất để nghiên cứu sâu hơn, định danh bằng phân tích PCR và đặt tên chủng tuyển chọn.
2.2.1.2. Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
Khuẩn lạc riêng rẽ của các chủng được tuyển chọn được sử dụng để tách chiết ADN bằng Kit Anapure Bacterial DNA mini kit theo các bước sau:
- Thêm 150 L dịch chứa mẫu vi khuẩn vào ống eppendorf 1,5 mL vô trùng sau đó thêm vào 20 µL Proteinase K.
- Thêm 250 L Binding Buffer. Trộn đều bằng cách pipet lên xuống 10 lần hoặc vortex 10-15 giây. Ủ mẫu ở 70oC trong 15 phút.
- Thêm 150 L Ethanol 96o. Vortex mẫu 10-15 giây hoặc pipet lên xuống 3-5 lần. - Chuyển mẫu ở bước 3 sang cột lọc SC01 (ANAPURE filter spin column) đặt trên ống thu dịch CT01 (ANAPURE collection tube).
- Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12 000 vòng/phút trong 1 phút. Đổ bỏ dịch chảy qua cột.
- Thêm 500 L Washing Buffer 1 vào cột lọc SC01. Lặp lại bước 5.
- Thêm 500 L Washing Buffer 2 vào cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc-ống thu dịch SC01-CT01 ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 2 phút. Chú ý cần loại bỏ hoàn toàn WB2 vì WB2 ảnh hưởng tới việc chiết đẩy ADN.
- Nhấc cột lọc SC01 chuyển sang ống thu mẫu eppendorf 1,5 mL vô trùng mới. - Thêm 50-200 L Elution Buffer vào trung tâm của cột lọc SC01. Ly tâm cột lọc ống eppendorf ở tốc độ tối đa 12000 vòng/phút trong 1 phút.
- Thu dịch chảy qua cột chứa ADN trong ống eppendorf. Bảo quản sản phẩm ADN tinh sạch ở -20oC hoặc sử dụng ngay cho ứng dụng mong muốn.
ADN tinh sạch được phân tích kích thước và độ tinh sạch bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% (100V - 30 phút), nhuộm bởi EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV. ADN sau tinh sạch được dùng làm khuôn của PCR khuếch đại đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu 27F: 5’- AGAGTTTGATAMTGGCTCAG-3’ và 1527R: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’ và chu trình nhiệt 95°C/10 phút - 30 chu kỳ 94°C/30 giây + 60°C/30 giây + 72°C/1 phút 30 giây - 72°C/5 phút - 4°C/∞. Thành phần của mỗi phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA được liệt kê dưới đây:
Thành phần Thể tích cho mỗi phản ứng (µL)
Nước cất 15,75
dNTP mix 2,5
10x Buffer 2,5
Forward primer (27F – 10 pmol) 1,0 Reverse primer (1527R – 10 pmol) 1,0 Enzyme mix (Taq polymerase) 0,25
ADN 2,0
Tổng thể tích 25
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm EtBr và được quan sát dưới ánh sáng UV để kiểm tra kết quả. Sản phẩm PCR dương tính được tinh sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất sử dụng Anapure PCR purification mini kit (ANABIO R&D). Sản phẩm PCR sau tinh sạch được điện di kiểm tra bằng gel agarose 1%, nhuộm bởi EtBr và quan sát dưới ánh sáng UV. Băng có kích thước khoảng 1500 base pair được gửi đi 1st BASE DNA Sequencing Services để giải trình tự ADN. Các trình tự ADN sau đó được phân tích bằng phần mềm Geneious Prime
và so sánh với dữ liệu có sẵn trong ngân hàng gen của NCBI (GenBank) sử dụng chương trình BLAST nhằm tìm ra chủng có trình tự gần nhất với tỉ lệ tương đồng. Tên chủng vi khuẩn được đặt tên, định danh dựa vào kết quả BLAST. Các dữ liệu liên quan được trích xuất ở dạng FASTA để phục vụ cho phân tích phát sinh chủng loại.
2.2.2. Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩnđược tuyển chọn ở điều kiện in-vitro được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro
2.2.2.1. Khả năng sinh trưởng
Chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi lắc trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường MRS lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc. Đo mật độ vi khuẩn ở mỗi mẫu bằng máy đo quang phổ ở OD620 và vẽ đường cong sinh trưởng tại các mốc thời gian [8].
2.2.2.2. Khả năng sinh axit lactic
Thí nghiệm này được thực hiện song song với thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng. Sau khi tiếp giống, chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng tiếp tục được nuôi lắc ở 37oC ở 200 vòng/ phút trong môi trường MRS chuẩn pH 6,5. Tại mỗi mốc thời gian, hút ra 10 mL dịch nuôi lắc, ly tâm và cho vào cốc thủy tinh, bổ sung thêm 20 mL nước cất và 1-2 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90o). Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích dung dịch NaOH đã dùng để chuẩn độ [68]. Độ axit tính theo độ Therner: oT = VNaOHtiêu tốn x 10, % axit lactic = oT x 0,009; trong đó: oT là độ Therner, 1oT tương ứng với 9 mg axit lactic.
2.2.2.3. Khả năng chịu muối mật
Dựa theo phương pháp của Todorov và đồng tác giả (2011); Colombo và đồng tác giả (2018), phương pháp thử khả năng chịu muối mật của chủng tuyển chọn được thực hiện như sau: Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang bình chứa môi trường muối mật 0,3% và 3,0% lỏng khác sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620 khoảng ~ 0,3) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Chủng vi khuẩn nuôi trong môi trường MRS không chứa muối mật được dùng làm đối chứng. Đo OD lúc 0 giờ và sau 4 giờ nuôi lắc
ở 37oC để xác định khả năng chịu muối mật của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].
2.2.2.4. Khả năng chịu axit
Nuôi lắc chủng được tuyển chọn và chủng đối chứng trong môi trường MRS lỏng (chuẩn pH 6,5), nhiệt độ 37oC, 200 vòng/phút dưới điều kiện kị khí ở bình cấp giống trong 12 giờ. Sau đó tiếp giống (10%) sang các bình chứa môi trường MRS đã chuẩn pH lần lượt là 2, 3, 4, 5 và 6 (chuẩn pH bằng dung dịch HCl 1M) sao cho OD620 đầu vào của chủng tuyển chọn và chủng đối chứng là bằng nhau (OD620
khoảng ~ 0,2) và tiếp tục nuôi lắc với điều kiện như trên. Đo OD620 tại 0 giờ và sau 3 giờ để xác định khả năng chịu axit của chủng vi khuẩn được tuyển chọn [97], [26].
2.2.2.5. Khả năng sinh H2O2
Chủng tuyển chọn và chủng đối chứng được nuôi cấy trong môi trường thạch MRS có bổ sung thêm 250 µg/mL 3-3’-5-5’ tetramethylbenzidine và 0,01 mg/mL horse radish peroxidase. Quan sát cường độ màu được phân loại giúp xác định khả năng sinh H2O2 [19].
2.2.2.6. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh
Các kháng sinh được sử dụng là (C) Chloramphenicol 30 µg, (E) Erythromycin 15 µg, (TE) Tetracycline 30 µg, (CTX) Cefotaxine 30 µg, (AMP) Ampicillin 10 µg, (CN) Gentamicin 10 µg, (CIP) Ciprofloxacin 5 µg. Sử dụng khoanh giấy kháng sinh đặt trên môi trường đã cấy trải các chủng vi khuẩn nghiên cứu, đường kính vòng ức chế được đo sau khi ủ đĩa ở 37oC trong 48 giờ dưới điều kiện kị khí [107], [106].
2.2.2.7. Khả năng tạo màng biofilm
Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể.
Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% được thực hiện như sau: khuẩn lạc các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nuôi cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10 mL môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37oC trong điều kiện kị khí và chỉnh mật độ tế bào OD620 khoảng ~ 0,6. Hút 100 L dịch nuôi cấy vi khuẩn đã nuôi lắc bổ sung vào 700 L môi trường MRS lỏng trong các ống eppendorf (2 mL hoặc 1,5 mL) đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó, dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống
trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở OD620 trong dịch nuôi cấy vi khuẩn [72].
Quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật theo phương pháp sau: mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung thêm 1 mL dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1 mL ethanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo OD620 [65].
2.2.2.8. Khả năng kháng với các chủng vi khuẩn và nấm có hại
Sau khi nuôi lắc qua đêm chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở 37oC trong môi trường MRS lỏng, chỉnh dịch nuôi lắc về pH 7 rồi nhỏ 150 µL dịch nuôi lắc vào mỗi lỗ thạch trên đĩa môi trường đã được cấy trải các chủng vi sinh vật gây hại: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922 và nấm C. albicans JCM 2070.
Quan sát đĩa thạch sau 24 - 48 giờ và đo đường kính vòng ức chế xung quanh