PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi sinh vật nghiên cứu
*Hình thái khuẩn lạc của chủng vi sinh vật lựa chọn trên môi trường thạch
Hình thái, màu sắc, đặc điểm và kích thước khuẩn lạc của các chủng VSV trên môi trường thạch chọn lọc được tiến hành quan sát sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 28 - 30oC. Môi trường HKTS được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn và môi trường Hansen được sử dụng để nuôi cấy nấm men.
*Quan sát hình thái tế bào của chủng vi sinh vật lựa chọn dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
Hòa sinh khối chủng VSV lựa chọn vào 1ml dung dịch đệm phosphat (PBS). Ly tâm 4000 v/ph trong 5 phút để thu sinh khối. Bổ sung 0,5 ml dung dịch glutaraldehyde 2,5% để cố định mẫu. Trộn đều dung dịch đã cố định và trải đều các lớp mỏng trên lamen có bổ sung polylizin 1%. Tiếp tục sử dụng dung dịch OsO4 1% để cố định lại mẫu. Rửa lại mẫu sau khi cố định bằng dung dịch cồn với nồng độ khác nhau 50%, 70%, 80%, 90% và 100%, Mẫu được xử lý và chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM-Scanning Electron Microscope) (S- 4800, Nhật Bản với hiệu điện thế là 10 kv) tại phòng kính hiển vi điện tử, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương.
*Xác định sự hình thành bào tử bằng phương pháp sốc nhiệt
Sau 72 giờ nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa HKTS, sinh khối chủng vi khuẩn nghiên cứu được hòa tan trong ống nghiệm chứa muối sinh lý 0,85%. Chủng đối chứng dương và đối chứng âm lần lượt là Bacillus sp.và Escherichia
coli. Chủng nghiên cứu và các chủng đối chứng được tiến hành sốc nhiệt ở 80oC
trong 15 phút để xác định khả năng hình thành bào tử. Sau đó gạt dịch nuôi cấy trên môi trường hiếu khí, ủ ở 30oC trong 24 đến 48 giờ để kiểm tra sự sống sót của chủng vi khuẩn nghiên cứu và các chủng đối chứng sau khi đã sốc nhiệt. Nếu sau khi sốc nhiệt chủng vi khuẩn nào phát triển trở lại chứng tỏ chủng vi khuẩn đó có khả năng hình thành bào tử.