PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH bằng chỉ số nhũ hóa E24
Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng nghiên cứu được đánh giá dựa trên chỉ số nhũ hóa E24. Chỉ số nhũ hoá (E24) đặc trưng cho khả năng nhũ hoá của CHĐBMSH do VSV tạo ra với dung môi (xylene và n-hexan) sau 24 giờ [12].
Cách tiến hành: Hút 1 ml dịch nuôi cấy của chủng nghiên cứu vào 1 ml dung môi (xylen hoặc n-hexan), vortex đều (2000 vòng/2 phút), ủ ở 4o
C trong 24 giờ và đo chỉ số nhũ hóa E24.
Chỉ số nhũ hoá (E24) được tính theo công thức: E 24 = Chiều cao cột nhũ hóa
Chiều cao tổng số × 100%
2.2.3. Sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp CHĐBMSH có khả năng ức chế vi khuẩn KSF
Tiến hành sàng lọc tuyển chọn chủng VSV sinh tổng hợp CHĐBMSH có khả năng ức chế tốt nhất sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng vi khuẩn KSF (Desulfovibrio vulgaris DSM 644 và Desulfovibrio sp RP3-303). Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của các CHĐBMSH từ các chủng VSV lựa chọn được đánh giá dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF thông qua kết tủa FeS (màu đen) sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung CHĐBMSH nghiên cứu với hàm lượng 0,1 và 0,5% (w/v). CHĐBMSH thu được được bổ sung sau khi lọc qua màng lọc vô trùng 0,45 µm. Vi khuẩn KSF ở cuối pha log được bổ sung với hàm lượng ban đầu là 105 CFU/ml.
2.2.4. Xác định đặc điểm sinh hóa của chủng nghiên cứu bằng kít chuẩn sinh hóa API
Đặc điểm sinh hóa chủng VSV nghiên cứu được xác định bằng kít chuẩn API 50 CHB (Biomerieux – Pháp). Các thao tác được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (https://apiweb.biomerieux.com). Kết quả được tra trên phần mềm API LAP Plus hoặc đối chiếu (profile index) để xác định tên chi/loài.
2.2.5. Phân loại chủng vi khuẩn nghiên cứu bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA
Chủng vi khuẩn nghiên cứu được phân loại dựa trên kit chuẩn sinh hóa API 50 CHB kết hợp với xác định trình tự gen 16S rRNA.
Gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn nghiên cứu được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi 27F (5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3') và 1492R (5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3') theo
chu trình nhiệt: 94oC trong 5 phút, 30 chu trình (94oC trong 60 giây, 55o
C trong 60 giây, 72oC trong 90 giây), 72oC trong 10 phút, giữ mẫu ở 4oC. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích trên máy đọc trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả giải trình tự gen hai chiều được kiểm tra bằng phần mền phân tích DNA STAR (Laserhene Inc., Madison, WI, Mỹ). Mức độ tương đồng gen 16S rRNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen 16S rRNA trong Genbank bằng công cụ BLAST trên NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
2.2.6. Nuôi cấy và làm giàu vi khuẩn KSF
Vi khuẩn KSF được nuôi cấy làm giàu trên môi trường DSMZ (medium 63). Tất cả môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện kỵ khí theo phương pháp của Hungate cải tiến [34].
* Xác định số lượng vi khuẩn khử sulfate bằng phương pháp pha loãng tới hạn (most probable number-MPN)
Mẫu nước được pha loãng theo tỷ lệ 1:10 trong dung dịch muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng. Hút 1 ml mẫu vào 9 ml dung dịch muối sinh lý được độ pha loãng 10-1. Tùy theo mật độ VSV mà ta tiếp tục pha loãng đến nồng độ phù hợp (10-3, 10-4, 10-5, 10-6...).
Hút 1 ml dịch mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau vào ống Hungate kỵ khí chứa 9 ml môi trường vi khuẩn KSF (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần). Vi khuẩn KSF được nuôi cấy ở 30oC. Số lượng vi khuẩn KSF được xác định bằng phương pháp xác suất thống kê của Man (1983) [32]. Sau 7 ngày nuôi cấy thông qua kết tủa FeS màu đen được tạo bởi phản ứng giữa sulfide do vi khuẩn KSF tạo ra và Fe2+ trong môi trường nuôi cấy.
2.2.7. Xác định hàm lƣợng sulfide
Hàm lượng sulfide hòa tan được xác định bằng phương pháp so màu dựa trên kết tủa CuS bằng máy quang phổ [7].
2.2.8. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng vi khuẩn lựa chọn
*Ảnh hưởng của nguồn carbon:
Để tìm nguồn carbon thích hợp cho việc tổng hợp CHĐBMSH, chủng vi khuẩn nghiên cứu được nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung 0,3% (w/v) KNO3 và 3% (w/v) các nguồn carbon khác nhau (glucose, glycerol, dầu DO, dầu đậu nành, dầu oliu và dầu thô) ở 30oC, pH 7. Nguồn carbon phù hợp cho quá trình tạo CHĐBMSH được đánh giá sau 3 ngày nuôi cấy qua chỉ số nhũ hóa E24.
*Ảnh hưởng của nguồn nitơ:
Để tìm nguồn nitơ thích hợp cho việc tổng hợp CHĐBMSH, chủng nghiên cứu được nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung 3% (w/v) glucose và 0,3% (w/v) các nguồn nitơ khác nhau (KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, Urea và NaNO3) ở 30o
C, pH 7. Nguồn nitơ phù hợp cho quá trình tạo CHĐBMSH được đánh giá sau 3 ngày nuôi cấy qua chỉ số nhũ hóa E24.
*Ảnh hưởng của pH
Khả năng tạo CHĐBMSH của chủng nghiên cứu được đánh giá ở các giá trị pH 5, 6, 7, 8 và 9. Chủng này được nuôi cấy trong môi trường khoáng ở các pH khác nhau có bổ sung 3% (w/v) glucose và 0,3% (w/v) NaNO3 ở 30o
C. Giá trị pH phù hợp cho quá trình tạo CHĐBMSH được đánh giá sau 3 ngày nuôi cấy qua chỉ số nhũ hóa E24.
*Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khả năng tạo CHĐBMSH của chủng nghiên cứu được đánh giá trong khoảng nhiệt độ 25, 30, 37, 45 và 55oC sau 3 ngày nuôi cấy. Chủng này được nuôi cấy trong môi trường khoáng ở các nhiệt độ khác nhau có bổ sung 3% (w/v) glucose và 0,3% (w/v) NaNO3, pH 8. Nhiệt độ phù hợp cho quá trình tạo CHĐBMSH được đánh giá sau 3 ngày nuôi cấy qua chỉ số nhũ hóa E24.
2.2.9. Nghiên cứu động thái sinh trƣởng và sự sinh tổng hợp CHĐBMSH từ chủng lựa chọn
Chủng vi khuẩn 310-RP3-1 được ria trên môi trường thạch đĩa HKTS và nuôi cấy 24 giờ ở 37o
tục hoạt hóa chủng 310-RP3-1 qua đêm (8 - 12 tiếng) trên môi trường dịch HKTS ở 37oC cho đến khi mật độ tế bào đạt 108
CFU/ml. 3% (v/v) dịch nuôi cấy sau khi hoạt hóa của chủng 310-RP3-1 được bổ sung vào các thí nghiệm để nghiên cứu động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng này. Môi trường sử dụng nghiên cứu động thái sinh trưởng là môi trường khoáng với nguồn cơ chất và điều kiện nuôi cấy phù hợp: 3% (w/v) glucose, 0,3% (w/v) NaNO3, pH 8 và 37oC. Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 500 ml với thể tích nuôi cấy là 150 ml sau 3, 6, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.
2.2.10. Lên men, tách chiết CHĐBMSH
Chủng vi khuẩn nghiên cứu được lên men trên môi trường khoáng có bổ sung 3% (w/v) glucose, 0,3% (w/v) NaNO3 ở 37oC, pH 8. Sau 3 ngày, CHĐBMSH được tách chiết từ dịch lên men như sau:
Dịch lên men được ly tâm để loại bỏ tế bào. Sau khi loại bỏ hết tế bào, dịch còn lại được chỉnh xuống pH 2 bằng HCl đặc rồi để ở 4oC qua đêm đến khi kết tủa hoàn toàn. Sau đó, dịch kết tủa được ly tâm để thu hồi CHĐBMSH thô. CHĐBMSH được làm khô bằng speedvac nhẹ. CHĐBMSH thô được làm kiềm hóa bằng dung dịch NaHCO3 0,1 M (pH 7,5). Sau khi ly tâm, kết tủa (CHĐBMSH thô) được chiết bằng dung dịch chloroform: ethanol (2:1) với tỷ lệ 1:1 (v/v). Lắc đảo đều dịch chiết trong 10 phút, thu dịch pha trên bằng phễu chiết. Lặp lại bước chiết 03 lần. Làm khô sản phẩm bằng thiết bị cô quay chân không [5].
2.2.11. Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tạo ra từ chủng vi khuẩn lựa chọn
Để xác hàm lượng ức chế (MIC) và diệt (MBC) tối thiểu của CHĐBMSH nghiên cứu đối với các chủng vi khuẩn KSF, các thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp tiêu chuẩn của Das và cộng sự, 2008 [14]. Hiệu lực ức chế được đánh giá dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF thông qua kết tủa FeS (màu
đen) và hàm lượng H2S tạo ra sau 1, 3, 5 và 7 ngày trên môi trường KSF đặc hiệu bổ sung CHĐBMSH nghiên cứu với các hàm lượng khác nhau (0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 và 1% (w/v)).
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học cao
Từ các mẫu bùn và nước thu được tại Vũng Tàu, Thanh Hóa, Huế và Hưng Yên, 16 chủng VSV (14 chủng vi khuẩn và 2 chủng nấm men) đã được phân lập và tuyển chọn dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, đặc điểm sinh lý sinh hóa. Các chủng nghiên cứu được hoạt hóa, nuôi cấy và tinh sạch trên môi trường thạch hiếu khí tổng số (HKTS) ở 30oC. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng này được xác định bằng chỉ số nhũ hóa E24 sau khi nuôi lắc (180 v/p) trên môi trường khoáng ở 30oC trong 3 - 5 ngày (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng vi khuẩn và nấm men phân lập được
STT Loại VSV Ký hiệu chủng Địa điểm lấy mẫu
Chỉ số nhũ hóa E24 (%)
1 Vi khuẩn CCMB1 Huế 11,5
2 CCMB2 Huế 84
3 AHVT3.4 Thanh Hóa 79
4 AHVT3.6 Thanh Hóa 13,5
5 DM3 Hưng Yên 42 6 DM4 Hưng Yên 34 7 DM5 Hưng Yên 28 8 DM16 Hưng Yên 50 9 DM26 Hưng Yên 52 10 1214-BK14 Vũng Tàu 56 11 310-RP3-1 Vũng Tàu 53,5 12 TD2 Vũng Tàu 73 13 917-G9 Vũng Tàu 58 14 BK3 Vũng Tàu 44 15 Nấm men NM-487-BK5 Vũng Tàu 51 16 NM-310-RP3-2 Vũng Tàu 50
Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của các chủng VSV nghiên cứu được đánh giá qua chỉ số nhũ hóa E24. Trong nghiên cứu này, chỉ số nhũ hóa E24 đặc trưng cho khả năng nhũ hóa với xylen của sản phẩm trao đổi chất do vi khuẩn tạo ra. Các chủng VSV này được nuôi lắc trên môi trường khoáng có bổ sung 2% (w/v) glucose, glycerol, dầu DO, dầu đậu nành, dầu oliu và dầu thô là nguồn carbon. Khả năng tạo CHĐBMSH đạt cao nhất của các chủng này trong 3 - 5 ngày nuôi cấy được trình bày ở Bảng 3.1. Kết quả cho thấy, trong số 16 chủng VSV nghiên cứu thì 10 chủng có chỉ số nhũ hóa E24 đạt trên 50% sau 3 - 5 ngày nuôi cấy. Do đó, 10 chủng VSV, trong đó có 8 chủng vi khuẩn (CCMB2, AHVT3.4, DM16, DM26, 1214BK14, 310-RP3-1, TD2, 917G9) và 2 chủng nấm men (NM-487BK5, NM-310RP3-2) được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Sàng lọc tuyển chọn chủng vi sinh vật tổng hợp CHĐBMSH ức chế vi khuẩn khử sulfate
Trong số 10 chủng VSV có khả năng tổng hợp CHĐBMSH được lựa chọn ở trên, tiến hành sàng lọc tuyển chọn chủng VSV tổng hợp CHĐBMSH có khả năng ức chế tốt nhất sự sinh trưởng và phát triển của 02 chủng vi khuẩn KSF nghiên cứu (Desulfovibrio vulgaris DSM 644 và chủng Desulfovibrio sp. RP3-303). CHĐBMSH của 10 chủng lựa chọn sau 3 - 5 ngày nuôi cấy được tách chiết và bổ sung vào môi trường vi khuẩn KSF đặc hiệu (DSMZ-Medium 63) với nồng độ 0,1 và 0,5% (w/v) sau khi lọc qua màng vô trùng 0,45 µm. Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần ở điều kiện kỵ khí với pH 7, 30oC. Vi khuẩn KSF ở cuối pha log được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với số lượng ban đầu là 105
CFU/ml. Khả năng kháng vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tổng hợp từ 10 chủng lựa chọn được đánh giá dựa trên sự sinh trưởng của vi khuẩn KSF thông qua kết tủa FeS (màu đen) sau 7 ngày tiếp xúc (Bảng 3.2).
Bảng 3.2. Khả năng ức chế vi khuẩn KSF của CHĐBMSH tổng hợp bởi 10 chủng VSV nghiên cứu
Nồng độ CHĐBMSH
(%)
Sinh trưởng của các chủng VSV lựa chọn sau 7 ngày CHĐBMSH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Desulfovibrio vulgaris DSM 644 0.1 + + + + + + + + + + 0.5 +/- + + + +/- - + + +/- + Desulfovibrio sp. RP3-303 0.1 + + + + + + + + + + 0.5 + + +/- + +/- - +/- + + + (+) Sinh trưởng tốt; (-) Không sinh trưởng; (+/-) Sinh trưởng trung bình;
(-/+) Sinh trưởng yếu
*Ký hiệu CHĐBMSH
1: CCMB2; 2: AHVT3.4; 3: DM16; 4: DM26; 5: 1214BK14; 6: 310-RP3-1; 7: TD2; 8: 917G9; 9: NM-487BK5; 10: NM-310-RP3-2
Kết quả (Bảng 3.2) cho thấy, trong số các CHĐBMSH tổng hợp từ 10 chủng VSV lựa chọn, CHĐBMSH được tổng hợp bởi chủng vi khuẩn 310-RP3- 1 phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu có khả năng ức chế vi khuẩn KSF tốt nhất sau 7 ngày. Do đó, chủng vi khuẩn 310-RP3-1 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 310-RP3-1
*Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn 310-RP3-1
Trên môi trường thạch HKTS, khuẩn lạc của chủng 310-RP3-1 có màu trắng đục, khô, mép phẳng, lan trên bề mặt thạch, đường kính 3 mm (Hình 3.1). Chủng này có tế bào hình que kích thước 1,5 – 7,2 µm (Hình 3.3). Chủng 310- RP3-1 thuộc nhóm vi khuẩn gram dương có khả năng sinh bào tử (Hình 3.2).
Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng 310-RP3-1
Hình 3.2.Chủng 310-RP3-1 sau khi sốc nhiệt (80oC, 15 phút)
Hình 3.3. Hình thái tế bào của chủng 310-RP3-1 dưới kính hiển vi điện tử quét (x 10.000)
*Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn 310-RP3-1
Chủng vi khuẩn 310-RP3-1 thuộc nhóm vi khuẩn gram dương, có khả năng sinh bào tử. Do đó, kít chuẩn sinh hóa API 50 CHB được lựa chọn để phân loại chủng này. Kết hợp các phản ứng sinh hóa trong kít chuẩn được đưa ra ở Bảng 3.3 và đặc điểm hình thái, sinh lý cho thấy chủng 310-RP3-1 thuộc
chi Bacillus.
Bảng 3.3. Kết quả các phản ứng sinh hoá của kit chuẩn API 50 CHB của chủng 310-RP3-1 Phản ứng 0 – 12 ống cơ chất Phản ứng 13 – 25 ống cơ chất Phản ứng 26 – 38 ống cơ chất Phản ứng 39 – 49 ống cơ chất
0 CONTROL - 13 MNE + 26 SAL + 39 GEN + 1 GLY + 14 SBE - 27 CEL + 40 TUR - 2 ERY - 15 RHA - 28 MAL - 41 LYX - 3 DARA - 16 DUL - 29 LAC - 42 TAG + 4 LARA + 17 INO - 30 MEL - 43 DFUC - 5 RIB + 18 MAN + 31 SAC + 44 LRUC - 6 DXYL - 19 SOR - 32 TRE + 45 DARL - 7 LXYL - 20 MDM - 33 INU - 46 LARL - 8 ADO - 21 MDG - 34 MLZ - 47 GNT - 9 MDX - 22 NAG + 35 RAF - 48 2KG - 10 GAL - 23 AMY + 36 AMD - 49 5KG - 11 GLU + 24 ARB + 37 GLYG - 50 SAL + 12 FRU + 25 ESC + 38 XLT -
*Phân loại chủng 310-RP3-1 bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA
Để xác định vị trí phân loại, chủng vi khuẩn 310-RP3-1 được phân tích trình tự gen 16S rRNA và so sánh trình tự thu được với Gen Bank để tìm những loài có trình tự tương đồng.
Hình 3.4. Vị trí phân loại của chủng vi khuẩn 310-RP3-1
Kết quả (Hình 3.4) cho thấy, chủng 310-RP3-1 có độ tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis SA4 KY285264.1, do đó chủng này có thể thuộc loài
B. subtilis và được ký hiệu là B. subtilis 310-RP3-1.
3.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng vi khuẩn lựa chọn
Để có thể nâng cao hiệu suất tổng hợp CHĐBMSH ức chế vi khuẩn KSF của chủng B. subtilis 310-RP3-1, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố (nguồn carbon, nitơ, pH và nhiệt độ) tới quá trình sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng vi khuẩn này là cần thiết.
*Ảnh hưởng của nguồn carbon
Để tìm nguồn carbon thích hợp cho sinh tổng hợp CHĐBMSH kháng vi khuẩn KSF, chủng B. subtilis 310-RP3-1 được nuôi lắc trên môi trường khoáng có bổ sung dầu thô, glycerol, glucose, DO, đậu nành và dầu oliu như nguồn carbon duy nhất. Khả năng sinh tổng hợp CHĐBMSH của chủng B. subtilis 310- RP3-1 được thể hiện thông qua chỉ số nhũ hóa E24.