ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm và yếu tố tuổi người mẹ
Dựa theo các nghiên cứu trước đó của Rubio và cộng sự năm 2013, chúng tôi chia các đối tượng nghiên cứu ra thành 2 nhóm: nhóm 1 là nhóm phôi có tuổi người mẹ nhỏ hơn 37 tuổi, nhóm 2 là nhóm phôi có tuổi người mẹ từ 37 tuổi trờ lên [51].
0 2 4 6 8 10 12 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y Mất đoạn NST Thêm đoạn NST
Theo đó, thống kê có 429 phôi có tuổi người mẹ < 37 tuổi (trung bình 32,06) chiếm 71,1%, 174 phôi có tuổi mẹ ≥ 37 tuổi (trung bình 39,63) chiếm 28,9% trên tổng sô 603 phôi thu thập trong nghiên cứu.
Bảng 12 Sự phân bố số lượng phôi ngày 5 trong TTTON theo độ tuổi của người mẹ Pearson chi2 (7) = 124,4794 pr = 0,000 Số lượng phôi <37 tuổi (Nhóm 1) ≥37 tuổi (Nhóm 2) Tổng số 3 13,52% 58 24,14% 42 16,58% 100 4 23,54% 101 17,82% 31 21,89% 132 5 34,97% 150 16,09% 28 29,52% 178 6 2,8% 12 21,26% 37 8,13% 49 7 9,79% 42 8,05% 14 9,29% 56 8 13,05% 56 4,6% 8 10,61% 64 10 2,33% 10 0% 0 1,66% 10 14 0% 0 8,05% 14 2,32% 14 Tổng số 429 100% 174 100% 603 100%
Trong tổng số 578 phôi được phân tích có 410 phôi có tuổi mẹ < 37 (32,06 ± 3,43) và 168 phôi có tuổi mẹ ≥ 37 tuổi (39,63 ± 2,96). Trong tổng số 603 mẫu phôi được thu thập từ 133 cặp đôi thực hiện TTTON và đồng ý tham gia nghiên cứu có số lượng phôi đa dạng, dao động từ 3 tới 14 phôi. Mặc dù đối tượng ở mỗi nhóm tuổi khác nhau thì có số lượng phôi khác nhau nhưng dựa trên số liệu bảng 12 cho thấy rõ ràng có mỗi quan hệ giữa số lượng phôi và yếu tố tuổi của người mẹ và các con số
này đều có nghĩa thống kê (p của c 2 test <0,05). Tuy nhiên, quy luật của mối quan hệ này chưa rõ ràng vì sự tác động qua lại này có thể phụ thuộc nhiều yếu tố.
Bảng 13 Kết quả phân tích 578 phôi phân chia theo độ tuổi của người mẹ
Pearson chi2(1) = 12,6506 pr = 0,000 (Nhóm 1) <37 tuổi (Nhóm 2) ≥37 tuổi Tổng số Tuổi trung bình 32,06 ± 3,43 39,63 ± 2,96 34,26 ± 4,76 Số phôi bình thường 61,95% 254 45,83% 77 57,27% 331 Số phôi bất thường NST 38,05% 156 54,17% 91 42,73% 247 Tổng số phôi 100% 410 100% 168 100% 578
Để tìm hiểu mối tương quan giữa tuổi người mẹ và tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm, chúng tôi thực hiện test khi bình phương. Kết quả nhận thấy, có mối liên hệ giữa tuổi người mẹ và tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm với độ tin cậy 95% và có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Dựa trên số liệu bảng 13, cho thấy đối với trường hợp người mẹ nhỏ hơn 37 tuổi, có 254/410 phôi không phát hiện bất thường số lượng nhiễm sắc thể và 156/410 phôi (chiếm 38,05%) có phát hiện bất thường nhiễm sắc thể. So sánh với tỷ lệ 54,17% bất thường NST ở nhóm đối tượng người mẹ có tuổi trên 37 (91/168).
Đặc biệt, khi đánh giá kết quả phân tích di truyền của các phôi ở nhóm tuổi này cho thấy đối với các phụ nữ lớn tuổi (> 37 tuổi) nguy cơ phôi mang bất thường nhiễm sắc thể rất cao, lên tới trên 50%. Tỷ lệ này tương đồng với kết quả của các nghiên cứu trước đó của Rubio và cộng sự năm 2013, tỷ lệ bất thường ở nhóm đối tượng không có tiền sử xảy thai liên tiếp nhiều lần và độ tuổi < 37 là 33,3%; trong khi ở nhóm đối tượng ≥ 37 là 57,7% [51]. Kết luận của Fraouli cũng cho rằng tỷ lệ lệch bội nhiễm sắc thể vượt trên 50% đối với hầu hết phụ nữ trên 40 tuổi [21].
Năm 2016, nhóm nghiên cứu của Matthew Rabinowitz sử dụng kỹ thuật single-nucleotide polymorphism (SNP) để đánh giá bất thường 24 nhiễm sắc thể ở phôi ngày 5 và kết quả cho thấy 55% phôi ngày 5 mang bộ NST bình thường. Và con số này giảm nhanh chóng khi người mẹ trên 35 tuổi [13].
Trong nghiên cứu mới nhất năm 2017, nhóm nghiên cứu của Upadhyaya kết luận tỷ lệ phôi nang mang bộ nhiễm sắc thể 2n bình thường ở nhóm đối tượng người mẹ nhỏ hơn 37 tuổi là 65,5% và giảm còn 40,6% khi tuổi người mẹ tăng trên 37 tuổi [36]. Mặc dù nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật a-CGH để đánh giá sự bất thường NST ở phôi, tuy nhiên, kết luận cho thấy tỷ lệ tác giả đưa ra có sự tương đồng cao với nghiên cứu này của chúng tôi khi sử dụng kỹ thuật PGS-NGS để đánh giá.
Tỷ lệ số lượng phôi có bất thường nhiễm sắc thể ở các nhóm tuổi là khác nhau; nhóm đối tượng 2 có tỷ lệ bất thường NST cao hơn nhóm 1 tới 16,12%. Sự thống kê tỷ lệ này dựa trên hàm Khi bình phương, kết quả cho thấy giá trị Peason Chi2(2) = 12,6506 và pr = 0,000 chứng tỏ rằng, hai yếu tố tuổi người mẹ và tỷ lệ phôi bình thường hay bất thường có mối quan hệ tác động lẫn nhau; nếu tuổi người mẹ càng cao nhất là trên 37 tuổi sẽ càng có nguy cơ tạo ra các phôi có bất thường về nhiễm sắc thể, đồng nghĩa với việc lượng phôi có bộ nhiễm sắc thể bình thường sẽ giảm xuống. Đúng như mong đợi, khi chúng tôi so sánh kết quả của mình với nghiên cứu của Alfarawati và cộng sự năm 2011, tỷ lệ bất thường NST cũng tăng dần khi tuổi người mẹ cao; cụ thể ở nhóm tuổi 38 - 47 (trung bình 41) là 60,7% cao hơn tỷ lệ ở nhóm tuổi từ 31 - 37 tuổi (trung bình 34,6) 9,7% [5]. Cả 2 nhóm tuổi này đều cao hơn 2 nhóm tuổi ở nghiên cứu của chúng tôi nên tỷ lệ bất thường NST phát hiện được cũng cao hơn.
Trong một nghiên cứu của Munné và cộng sự cũng cho thấy tỷ lệ phôi không mang bất thường NST giảm dần khi tuổi người mẹ tăng dần, cụ thể ở nhóm tuổi < 35 tuổi là 40%, tỷ lệ này giảm xuống 20% ở nhóm tuổi trên 41 tuổi [41].
Đặc biệt, trong nghiên cứu năm 2002, Munné đưa ra bằng chứng chứng minh mối quan hệ giữa tuổi người mẹ và sự bất thường NST ở phôi thụ tinh nhân tạo. Theo đó, ở nhóm tuổi người mẹ < 34,9, tỷ lệ phôi mang bất thường NST là 57,2%, ở nhóm
tuổi 35 – 39,9 là 58,9% và ở nhóm tuổi > 40 con số này là 65,1% [43]. Tuy nhiên, tác giả sử dụng phương pháp FISH để đánh giá bất thường nhiễm sắc thể và chỉ đánh giá trên một số NST như 13, 16, 18, 21, 22 và NST giới tính. FISH là một phương pháp cũ kèm theo một số hạn chế, do vậy không thể lọai trừ các trường hợp âm tính giả do không xác định được các bất thường trên NST khác.
Bên cạnh đó đi sâu vào việc đánh giá mức độ tương quan giữa yếu tố tuổi người mẹ và tỷ lệ bất thường số lượng NST chúng tôi tiến hành thống kê và xây dựng hệ số tương quan r sử dụng phần mềm thống kê STATA 14.
Hình 18 Mối tương quan giữa tuổi mẹ và tỷ lệ bất thường số lượng NST
r: hệ số tương quan; dấu * tức là hệ số khác 0 và có ý nghĩa thống kê.
Với hệ số tương quan thu được r = 0,4783 cho thấy mặc dù giữa yếu tố tuổi mẹ và tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể có mối liên hệ với nhau, tuy nhiên sự tương quan ở mức trung bình giữa hai yếu tố này, với độ chính xác 95% và có ý
nghĩa. Tuy nhiên, ta vẫn thấy rõ ràng tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể tăng nhanh chóng khi người mẹ sau tuổi 37.
Dưới đây là đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa tuổi người mẹ và bất thường số lượng NST (hình 19). Nhận thấy, cứ 22,87% sự biến đổi của tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể được giải thích bởi sự biến đổi của yếu tố tuổi mẹ (hệ số xác định R-square = 0,2287). Khi tuổi mẹ tăng thêm 1 đơn vị thì tỷ lệ bất thường số lượng nhiễm sắc thể sẽ tăng thêm 0.01 đơn vị và sự thay đổi này có ý nghĩa với độ tin cậy 95%. Như vậy, chúng tôi đưa ra phương trình thể hiện mối liên hệ này như sau:
Tỷ lệ bất thường số lượng NST = -0,7 + 0,01 x (tuổi mẹ)
Hình 19 Đường hồi quy tuyến tính thể hiện mối tương quan giữa tuổi mẹ và tỷ
lệ bất thường số lượng NST
R2: hệ số xác định
Dưới đây là kết quả đánh giá mối tương quan giữa tuổi người mẹ và đặc điểm bất thường nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm.
y = 0,01x - 0,07 R² = 0,2287 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 20 25 30 35 40 45 50 Tỷ lệ B T SL N ST Tuổi mẹ Tỷ lệ BT SLNST Linear (Tỷ lệ BT SLNST)
Bảng 14 Đặc điểm bất thường NST phân chia theo độ tuổi của người mẹ Peasrson chi2 (10) =4,8438 pr = 0,304 <37 tuổi (Nhóm 1) ≥37 tuổi (Nhóm 2) Tổng số Bất thường số lượng NST 68,59% 107 72,53% 66 70,04% 173 Bất thường cấu trúc NST 11,54% 18 10,99% 10 11,34% 28 Bất thường số lượng và cấu trúc NST 1,92% 3 5,49% 5 3,24% 8 Phôi thể khảm 26 16.67% 10 10.99% 36 14.57% Thể khảm kèm bất thường số lượng NST 2 1.28% 0 0% 2 0.84% Tổng số 100% 156 100% 91 100% 247
Như vậy, tuổi của người mẹ và tỷ lệ bất thường phôi thụ tinh trong ống nghiệm 5 ngày tuổi có mối liên hệ với nhau, nhưng mối quan hệ giữa đặc điểm bất thường và yếu tố tuổi người mẹ lại độc lập với nhau (p = 0,304).
Đặc điểm bất thường nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi TTTON bao gồm: bất thường số lượng nhiễm sắc thể, bất thường cấu trúc NST, bất thường dạng thể khảm hoặc các dạng kết hợp phức tạp như vừa bất thường số lượng vừa bất thường cấu trúc hoặc thể khảm có số lượng NST bất thường. Sau đây, chúng tôi tập trung vào việc đánh giá mối quan hệ giữa yếu tố tuổi người mẹ và 2 dạng bất thường phổ biến nhất là bất thường liên quan tới số lượng nhiễm sắc thể.
Hình 20 Đặc điểm rối loạn số lượng NST phân bố theo độ tuổi của người mẹ
Mặc dù hầu hết các nhiễm sắc thể hiện sự gia tăng xác suất lệch bội nhiễm sắc thể khi tuổi người mẹ tăng cao, nhưng hiệu ứng này trở nên ấn tượng hơn đối với một số nhiễm sắc thể. Nhiễm sắc thể bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi tuổi là NST số 14, số liệu cho thấy tỷ lệ lệch bội tăng gấp 3,7 lần ở nhóm bệnh nhân lớn tuổi (≥ 37 tuổi). Sau đó là tới NST số 7, tỷ lệ lệch bội tăng trên 3,3 lần và NST số 18 tăng 2,9 lần khi tuổi người mẹ tăng cao. So với mức tăng trung bình gấp khoảng 1,5 đến 2 lần đối với tất cả các nhiễm sắc thể số 2, 3, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Kết quả này khá tương đồng với nghiên cứu của Alfarawati và cộng sự năm 2011 kết luận, nhiễm sắc thể số 7 và 14 là nhóm có tỷ lệ bất thường số lượng tăng nhiều nhất khi tuổi mẹ tăng cao (gấp 5 - 6 lần), và đối với nhiễm sắc thể 2, 15, 17, 20, 22 tăng gấp 2 lần [5].
Trong các nghiên cứu trước đây, các tác giả chỉ tập trung vào đánh giá một vài nhiễm sắc thể có tỷ lệ cao, và gây ra các hội chứng nguy hại tới phôi như NST 13, 16, 18, 21, 22 và NST X. Các nhiễm sắc thể này còn có thể phát hiện trong quá trình mang thai ba tháng đầu mà hiếm nghiên cứu nào phát hiện bất thường số lượng của các NST khác. Chúng tôi thừa nhận rằng, các NST 13, 16, 18, 21 ,22 và NST X là 0.00% 2.00% 4.00% 6.00% 8.00% 10.00% 12.00% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 XY Tỷ lệ BT SLNST ở nhóm đối tượng <37 tuổi Tỷ lệ BT SLNST ở nhóm đối tượng ≧37 tuổi
các nhiễm sắc thể có tỷ lệ xảy ra bất thường cao, và cũng có xu hướng tăng khi tuổi người mẹ tăng. Điều đáng nói ở đây là chúng tôi phát hiện thấy NST số 7, 14 là các NST có tỷ lệ tăng đột biến khi tuổi người mẹ tăng cao nhất là khi hơn 37 tuổi. Như vậy chứng tỏ các NST số 7 và 14 nếu có bất thường số lượng NST thì có khả năng gây chết cho phôi cao hơn các NST 13, 16, 18, 21, 22 và NST X. Nguyên nhân có thể do NST số 7 (159 triệu bp), NST số 14 (105 triệu bp) có kích thước lớn do vậy khi bất thường số lượng NST sẽ làm mất cân bằng hệ gen từ đó dễ gây chết phôi trong quá trình nuôi cấy và làm tổ ở tử cung.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Từ việc phân tích trên 578 phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm, chúng tôi đưa ra một số kết luận chính như sau:
1. Xác định tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm 5 ngày tuổi bằng kỹ thuật PGS-NGS.
Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở phôi 5 ngày tuổi thụ tinh trong ống nghiệm trong quần thể người Việt Nam là 42,7%. Lệch bội nhiễm sắc thể có thể xảy ra ở tất cả các nhiễm sắc thể với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, cao nhất là các NST số 15, 16, 21, 22 và NST giới tính, ít gặp ở nhóm các NST số 7, 9, 11 và 19.
Tỷ lệ bất thường cấu trúc NST hiếm gặp ở NST số 12, 20 và 22 ở quần thể nghiên cứu.
2. Đánh giá mối tương quan giữa rối loạn số lượng nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm 5 ngày tuổi và yếu tố tuổi người mẹ.
Tỷ lệ phôi mang bất thường NST và yếu tố tuổi người mẹ có mối tương quan thuận với mức độ liên hệ ở mức trung bình (r=0,4783), nghĩa là tuổi người mẹ càng cao sẽ càng có nguy cơ tạo ra các phôi có bất thường về nhiễm sắc thể.
Sự thay đổi tỷ lệ bất thường NST theo độ tuổi là khác nhau ở các nhiễm sắc thể. Tuy nhiên nhiễm sắc thể bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi tuổi là NST số 14 sau đó là NST số 7 và 18.
Kiến nghị
Nghiên cứu và ứng dụng kết quả này vào việc tư vấn di truyền cho các bệnh nhân thực hiện thụ tinh nhân tạo tại các trung tâm TTTON ở khắp Việt Nam.
Nghiên cứu và phối hợp với các phương pháp truyền thống giúp tìm ra qui trình tối ưu để giúp giảm chi phí mà vẫn mang lại hiệu quả cao cho các bệnh nhân thực hiện thụ tinh nhân tạo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Kính Đ. Phôi thai học người, Nhà xuất bản Y học.
2. Minh H. V. (2014), Phương pháp nghiên cứu khoa học y học thống kê ứng dụng và phân tích số liệu, Nhà xuất bản Y học.
3. Nhân N. V., H. T. M. Thi and N. V. Q. Huy, "Kỹ thuật array CGH* và ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh".
Tiếng Anh
4. Al-Asmar N., V. Peinado, M. Vera, J. Remohí, A. Pellicer, C. Simón, T. Hassold and C. Rubio (2012), "Chromosomal abnormalities in embryos from couples with a previous aneuploid miscarriage", Fertility and sterility. 98(1), pp. 145-150.
5. Alfarawati S., E. Fragouli, P. Colls, J. Stevens, C. Gutiérrez-Mateo, W. B. Schoolcraft, M. G. Katz-Jaffe and D. Wells (2011), "The relationship between blastocyst morphology, chromosomal abnormality, and embryo gender",
Fertility and sterility. 95(2), pp. 520-524.
6. Angell R., J. Xian and J. Keith (1993), "Chromosome anomalies in human oocytes in relation to age", Human Reproduction. 8(7), pp. 1047-1054.
7. Angell R. R., R. Aitken, P. Van Look, M. A. Lumsden and A. Templeton (1983), "Chromosome abnormalities in human embryos after in vitro fertilization", Nature. 303(5915), pp. 336.
8. Balaban B., K. Yakin, B. Urman, A. Isiklar and J. Tesarik (2004), "Pronuclear morphology predicts embryo development and chromosome constitution",
Reproductive BioMedicine Online. 8(6), pp. 695-700.
9. Campbell N. A. and J. B. Reece (2008), Biology, AP edition, chủ biên, Pearson/Benjamin Cummings Publishing, San Francisco, California.
10. Chi B., B. P. Coe, C. MacAulay and W. L. Lam (2004), "SeeGH–a software