1.5.1. Phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ - FISH
FISH là viết tắt của Flourescence in situ hybridization, được thiết kế để quan sát trực quan các biến đổi về di truyền của một tế bào. Mục đích chính của kỹ thuật này là nhằm chứng minh sự mất cân bằng như tăng hoặc giảm các phân đoạn của nhiễm sắc thể. FISH ban đầu được giới thiệu để phân biệt các nhiễm sắc thể, tuy nhiên kỹ thuật này ngày càng được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học và sinh học khác nhau. Một trong số đó phải kể tới ứng dụng của FISH như một công cụ chẩn đoán phân tích nhiễm sắc thể và gen trong di truyền học lâm sàng và ung thư.
Lai tại chỗ (In situ hybridization, ISH) được định nghĩa cố định hình thái học của các yếu tố di truyền tại chỗ, nhằm mục đích xác định sự có mặt hay vắng mặt của các ADN hay ARN nhất định để xác định vị trí của loài hoặc vị trí của các nhiễm sắc thể. Việc xác định này dựa trên nguyên lý về sự bắt cặp với nhau. Do vậy không chỉ lai giữa 2 mạch bổ sung của ADN với nhau, mà người ta còn có thể lai AND - ARN, ARN - ARN hoặc các axit nucleic nhân tạo và tự nhiên với nhau. Để phát hiện sự kết hợp này có xảy ra hay không người ta thường dùng chất chỉ thị là các đồng vị phóng xạ hoặc không đồng vị (ví dụ như huỳnh quang) [14].
Hình 4 Sơđồ giải thích nguyên lý cơ bản của kỹ thuật FISH [24]
Kỹ thuật FISH có các yêu cầu khi ứng dụng: Đầu dò sử dụng phải có các trình tự đặc hiệu tương thích với trình tự cần phát hiện. Các đầu dò này phải được gắn với chất chỉ thị là huỳnh quang với các màu thích hợp. Mẫu tế bào phải đảm bảo cố định về mặt hình thái học nguyên vẹn để xác định vị trí của các nhãn đầu dò sau khi lai [14]. Sự bắt cặp đặc hiệu giữa đầu dò và nhiễm sắc thể hoặc với ADN được biểu diễn ở hình 4. Đầu tiên, ADN đích như nhiễm sắc thể hay nucleic được gắn trên bề mặt của lam kính. ADN sau đó bị biến tính bởi nhiệt mỗi trước và sau bổ sung các dung dịch đặc biệt cho phép sự bắt cặp hoặc lai xảy ra hoàn toàn giữa sợi đơn đầu dò và ADN đích. Các đầu dò không được bắt cặp sẽ được rửa đi. Các phản ứng đặc hiệu xảy ra giữa đầu dò và ADN đích sẽ được hiển thị nhờ việc quan sát màu huỳnh quang khi soi dưới kính hiển vi (hình 4).
1.5.2. Phương pháp lai so sánh hệ gen (a-CGH)
Lai so sánh hệ gen là một phương pháp ứng dụng để phân tích số bản sao cấp độ phân tử tế bào của một mẫu thử nghiệm so với một mẫu tham chiếu mà không cần nuôi cấy tế bào. Mục đích của phương pháp này là so sánh nhanh chóng và hiệu quả hai mẫu ADN từ hai nguồn khác nhau, nhưng có quan hệ gần gũi, vì nghi ngờ giữa chúng có sự khác biệt về số lượng của nhiễm sắc thể (tăng hoặc giảm nhiễm sắc thể) hoặc một vùng trên nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này ban đầu được phát triển để phát hiện sự khác biệt về nhiễm sắc thể giữa tế bào của khối u rắn và tế bào mô bình thường [34] và nhận thấy độ phân giải của kỹ thuật này cao hơn so với các kỹ thuật phân tích tế bào học truyền thống sử dụng giemsa và FISH chỉ sử dụng kính hiển vi do vậy giới hạn độ phân giải phụ thuộc vào kính được sử dụng [47, 68].
Trong thập niên 1990 kỹ thuật CGH bắt đầu được phát triển. Về bản chất kỹ thuật này cũng tương tự kỹ thuật FISH nhưng cho phép đánh giá trên toàn bộ hệ gen tình trạng mất cân bằng của bộ NST. CGH cũng vấp phải giới hạn về độ phân giải, kỹ thuật CGH trong giai đoạn này chỉ cho phép phát hiện các bất thường có kích thước trong giới hạn 10 – 20 Mb [34] và trong một số nghiên cứu kích thước nằm trong giới hạn 5 – 10 Mb [47]. Vào cuối thập niên 1990 kỹ thuật a-CGH ra đời cho phép giải quyết những vấn đề tồn đọng của kỹ thuật CGH và khắc phục những nhược điểm của kỹ thuật lập karyotype và kỹ thuật FISH. Với a-CGH, những bất thường trên NST xảy ra ở dưới mức phát hiện của kính hiển vi (submicroscopic) thuộc dạng vi mất đoạn (microdeletion) hoặc vi lặp đoạn (microduplication) có thể được phát hiện một cách dễ dàng [3].
Kỹ thuật a-CGH thực hiện việc so sánh mẫu ADN cần phân tích với mẫu ADN chứng và thông qua sự khác biệt giữa hai ADN này để phát hiện các trường hợp mất đoạn hoặc nhân đoạn nếu có trên ADN. Nguyên lý của kỹ thuật a-CGH được dựa trên khả năng bắt cặp (base pair) hoặc còn được gọi một cách khác là lai (hybridise) giữa một mạch đơn của ADN này và một mạch đơn của ADN khác theo nguyên tắc bổ sung giữa các bazơ Adenine (A) và Thymine (T), Guanine (G) và Cytosine (C) của các nucleotide. Trong kỹ thuật a-CGH, hàng ngàn đoạn ngắn ADN (gọi là các đoạn
dò) được sắp xếp một cách chính xác tại những vị trí nhất định trên lam kính thành một hệ thống lưới được gọi là con chip. Đầu tiên mẫu ADN cần phân tích sẽ được cắt thành những đoạn ngắn, những đoạn ADN này được nhuộm màu huỳnh quang, mẫu ADN chứng không mang bất thường về mặt di truyền sẽ được nhuộm bằng một màu huỳnh quang khác, hai loại màu huỳnh quang được sử dụng phổ biến là màu đỏ và xanh lục. Sau đó hai mẫu ADN này sẽ được trộn lẫn với nhau và cho lên con chip để tiến hành quá trình lai. Các đoạn ADN này sẽ lai với các đoạn dò tương ứng trên con chip. Sau khi hoàn tất quá trình lai con chip sẽ được đọc trên máy quét microarray (microarray scanner) để đo lượng huỳnh quang màu đỏ và xanh lục ứng với mỗi vị trí trên con chip [47, 62, 63] và phân tích bằng phần mềm chuyên dụng trên máy tính để tính tỷ số giữa màu huỳnh quang đỏ và xanh lục tại mỗi vị trí ứng với một đoạn dò đặc hiệu trên chip để xác định tình trạng thừa, thiếu hoăc cân bằng vật liệu di truyền giữa mẫu ADN cần phân tích và ADN chứng tại vị trí đó [10, 31]. Nếu mẫu ADN cần phân tích có lượng bình thường sẽ thể hiện trên chip bằng màu vàng do có sự cân bằng giữa lượng ADN cần phân tích và mẫu ADN chứng, nếu bị thừa ADN (nhân đoạn) sẽ thể hiện bằng màu đỏ do có lượng ADN cần phân tích nhiều hơn so với mẫu ADN chứng và nếu bị thiếu ADN (mất đoạn) sẽ thể hiện bằng màu xanh lá cây do có lượng ADN cần phân tích ít hơn so với mẫu ADN chứng [3]. Các bước ở bản của quá trình này được thể hiện ở hình 5.
Hình 5 Sơđồ minh họa các bước cơ bản trong kỹ thuật array CGH[29]
Để đánh giá trình trạng bình thường, thừa hoặc mất đoạn của ADN cần phân tích so với ADN chứng ứng tại mỗi vị trí của đoạn dò, log2 tỷ số của cường độ bắt màu huỳnh quang giữa mẫu bệnh / mẫu đối chứng được sử dụng để tính toán [52].
Hiện nay vấn đề ứng dụng kỹ thuật array CGH cũng như giá trị của nó trong chẩn đoán trước sinh vẫn còn đang được tiếp tục thảo luận. Việc sử dụng array CGH có mục tiêu (targeted array CGH) được đề xuất sử dụng trong chẩn đoán trước sinh để làm tăng khả năng phát hiện các bất thường NST [58] tuy nhiên việc chẩn đoán dựa trên các mục tiêu định sẵn như vậy cũng sẽ dẫn đến bỏ sót một số trường hợp bất thường không cân bằng của NST mà những bất thường này có thể dẫn đến những bất thường về mặt lâm sàng [64], đây là một hạn chế giống như những hạn chế của các kỹ thuật chẩn đoán trước sinh khác mặc dù ở mức độ nhỏ hơn.
1.5.3. Phương pháp sàng lọc di truyền truyền trước chuyển phôi sử dụng giải trình tự gen thế hệ thứ hai NGS. trình tự gen thế hệ thứ hai NGS.
Giải trình tự ADN đã xuất hiện từ rất lâu kể từ khi phương pháp kết thúc chuỗi của Sanger ra đời năm 1977 [53], giúp các nhà khoa học đã đạt được khả năng giải mã trình tự ADN một cách tin cậy. Sau đó, hãng Applied Biosystems đã giới thiệu các hệ thống giải trình tự tự động sử dụng điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE), AB370 vào năm 1987 và AB3730xl vào năm 1998, các thiết bị này trở thành công cụ chính hỗ trợ trong dự án giải trình tự hệ gen người[11]. Những công nghệ này được coi là các thiết bị có công suất cao thời bấy giờ, sau đó tới năm 2005 khi thiết bị Genome Analyzer xuất hiện vào năm 2005 đã có thể giải trình tự từ 84 kilobase (kb) đến 1 gigabase (Gb) trên 1 lần chạy.
Kỹ thuật giải trình tự các đoạn đọc ngắn, song song cùng lúc một lượng lớn đoạn đọc là một cách tiếp cận khác giúp tạo ra cuộc cách mạng lớn trong lịch sử giải trình tự và tạo ra giải trình tự thế hệ mới. Từ thời điểm đó trở đi, đầu ra dữ liệu của giải trình tự thế hệ tiếp theo (Next Generation Sequencing - NGS) đã tăng lên rất nhiều và cũng nhiều thế hệ thiết bị giải trình tự của các hãng ra đời và cải tiến [76].
Nguyên lý của kỹ thuật NGS dựa trên việc sử dụng phức hợp các enzymes ADN polymerase và các deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs) có gắn huỳnh quang, các phức hợp này tác động vào ADN khuôn trong từng chu kì tổng hợp ADN trong quá trình giải trình tự. Ở mỗi chu kì, các nucleotit được giải mã thông qua các dấu huỳnh quang gắn trên các nucleotit bổ sung. Sự khác biệt quan trọng là thay vì
giải trình tự từng đoạn ADN đơn lẻ, có trình tự ngắn thì NGS nâng cấp lên thành thực hiện trên hàng triệu đoạn đọc trong cùng một thời điểm. Hơn 90% dữ liệu giải trình tự gen trên thế giới được thực hiện bởi các hệ thống giải trình tự gen của hãng Illumina với công nghệ vừa sinh tổng hợp vừa đọc trình tự (Sequencing By Synthesis-SBS) với độ chính xác cao, dữ liệu đầu ra thành công lớn và khả năng đọc các nucleotit trên Q30 [76].
Qui trình giải trình tự gen của Illumina bao gồm 4 bước cơ bản (hình 6):
- Chuẩn bị thư viện: Các đoạn trình tự ADN hoặc cADN được cắt một cách ngẫu nhiên thành các đoạn ngắn, các đoạn này được gắn các trình tự vào hai đầu 5’ và 3’. Các trình tự được thêm vào bao gồm phần trình tự nucleotit để nhận biết các mẫu riêng biệt, phần tiếp theo là phần trình tự nucleotit bổ sung với các nucleotit trên giá thể của máy giải trình tự có tên gọi flowcell. Sau khi đoạn ADN được gắn hoàn thiện sẽ được khuếch đại sử dụng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và tinh sạch sản phẩm trước khi đưa vào giải trình tự.
- Tạo cluster: Thư viện sau khi chuẩn bị được chuyển vào flowcell nơi các đoạn đọc được bám vào, dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa trình tự gắn ở đầu 3’ và 5’ và các nucleotit gắn sẵn trên flowcell. Các đoạn ADN sau khi được bám trên flowcell sẽ được khuếch đại thành hàng triệu bản sao theo nguyên tắc bắc cầu tạo thành các cụm trình tự riêng biệt (cluster). Khi các cluster được hoàn thiện thì quá trình đọc trình tự có thể bắt đầu.
- Đọc trình tự: Enzyme ADN polymerase và mồi được bổ sung vào cùng với 4 loại nucleotit có gắn huỳnh quang mang gốc khóa ở 3’OH. Các nucleotit này sẽ bắt cặp với các nucleotit trên các mạch ADN trong cụm cluster theo nguyên tắc bổ sung, đồng thời làm cho phản ứng tổng hợp tạm thời dừng lại. Sau đó tia laser được chiếu vào để kích thích phát huỳnh quang và camera sẽ ghi lại huỳnh quang tương ứng với các nucleotit tại thời điểm đó. Kế tiếp, gốc khóa 3’OH được cắt ra, huỳnh quang cũng bị loại bỏ và rửa trôi cùng với các nucleotit không được gắn, chu trình lặp lại khi hết độ dài của trình tự đoạn đích.
- Phân tích dữ liệu: Các đoạn trinh tự sau khi giải trình tự được gắn với các trình tự tham chiếu để đưa ra kết quả là các trình tự cuối cùng. Đồng thời phần mềm phân tích sẽ so sánh và tách riêng trình tự các mẫu đầu vào thành các file riêng biệt.
Kỹ thuật này tạo ra cuộc cách mạng trong công nghệ sinh học và ứng dụng trong cả nghiên cứu và chẩn đoán lâm sàng. Việc ứng dụng công nghệ giải trình tự
gen thế hệ thứ hai ở một số nước châu Âu và châu Mỹ để phân tích NST của phôi nang bắt đầu áp dụng rộng rãi vào năm 2014 [18].
Sàng lọc rối loạn nhiễm sắc thể trước chuyển phôi dựa trên kỹ thuật NGS khác nhau rất nhiều so với các kỹ thuật khác. PGS-NGS thực hiện chỉ trên một hoặc một vài tế bào phôi, dữ liệu chính xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, các thiết bị đáng tin cậy và có giá thành hợp lý. Sàng lọc rối loạn NST dựa trên kỹ thuật NGS tạo ra nhiều lợi ích hơn a-CGH như giảm chi phí giải trình tự, có khả năng đánh giá tổn thương cấu trúc NST, khả năng tự động hóa cao giúp giảm thiểu những sai sót trong quá trình thực hiện [4, 39, 73].
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là các phôi nang, được tạo ra bằng phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn của các cặp vợ chồng làm thụ tinh trong ống nghiệm. Các phôi này được lấy trong khoảng thời gian từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 8 năm 2018 từ Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Miền Bắc Việt Nam: Bệnh viện Tâm Anh, Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội – Học viện Quân Y, Bệnh viện Nam học và Hiếm muộn Hà Nội. Các phôi này có các tiêu chuẩn sau: Toàn bộ phôi 5 ngày tuổi lấy lần lượt từ khi nghiên cứu cho đến khi đủ số lượng nghiên cứu, loại trừ các trường hợp dưới đây:
- Phôi của đối tượng có số lượng phôi ngày 3 dưới 4 phôi.
- Phôi của người mẹ có hai buồng trứng hoặc tử cung bất thường hoặc trường hợp không thực hiện theo chỉ dẫn của bác sĩ và nghiên cứu.
- Phôi của các trường hợp người thực hiện điều trị, nhận giao tử từ người khác.
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích.
2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích. Do vậy, chúng tôi tính cỡ mẫu cho nghiên cứu theo công thức trên phần mềm Sample Size của tổ chức Y tế Thế giới WHO :
N = Z2(1-a/2) x"($%")'(
Trong đó:
N = Cỡ mẫu tối thiểu
Z(1-⍺/2) biểu thị độ tin cậy. Nếu độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứng
với ⍺ = 5% thì Z(1-⍺/2) = 1,96
d là độ sai lệch của nghiên cứu so với thực tế (vì khi nghiên cứu là kết quả của
đồng sẽ có sai lệch d nhất định. Độ sai lệch này chỉ trong giới hạn 0,1% tới 10%. Chúng tôi chọn giá trị d = 0,055 để đảm bảo giới hạn cho phép về thống kê.
p là tỷ lệ đại diện cho tiêu thức nghiên cứu (tỷ lệ rối loạn nhiễm sắc thể) được
xác định ở mục tiêu nghiên cứu và liên quan đến độ sâu của nghiên cứu.
1 – p biểu thị tỷ lệ bình thường.
Áp dụng vào nghiên cứu này:
- Độ tin cậy = 95% tương ứng với ⍺ = 5% thì Z(1-⍺/2) = 1,96
- p = 56% = 0,56 (tỷ lệ phôi nang có bất thường nhiễm sắc thể theo nghiên cứu của F E. Fragouli D. Wells [21]
- q = 1- 0,56 = 0,44 - d = 0,055
Từ công thức trên, chúng tôi tính được cỡ mẫu cho nghiên cứu ít nhất là 313 phôi. Ở nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 603 phôi nang từ ba Trung tâm Hỗ trợ sinh sản trên.
2.2.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu