Sản phẩm của quá trình WGA được đưa về nồng độ 0,2 ng/µl trước khi tiến hành bước chuẩn bị thư viện. Chuẩn bị một đĩa PCR mới, đánh dấu VTA (Veriseq Tagment Amplicon Plate). Thêm 10 µl Tagment DNA Buffer vào mỗi giếng trên đĩa PCR sau đó bổ sung 5 µl Amplicon Tagment Mix vào các giếng đã chứa Tagment DNA Buffer. Cuối cùng cho 5 µl mẫu ADN nồng độ 0,2 ng/µl (trong 1ng ADN tổng số) vào các giếng tương ứng trên đĩa VTA; hút nhả pipet 5 lần để mix đều hoặc đậy nắp rồi vortex. Ly tâm ở 280 g ở nhiệt độ phòng trong 1 phút và chuyển đĩa VTA lên máy PCR theo chu trình nhiệt: 55 oC trong 5 phút và giữ ở 10 oC.
Khi kết thúc bước ủ, lấy VTA ra khỏi máy PCR, đem ly tâm và tiến hành bước tiếp theo. Ngay lập tức thêm 5 µl NT buffer vào mỗi giếng trên đĩa VTA ngay khi quá
trình ủ kết thúc. Sử dụng pipet hút nhả 5 lần để trộn đều hoặc sử dụng máy vortex sau đó ly tâm nhanh ở 280 g trong 1 phút và để ủ ở nhiệt độ thường trong 5 phút. Thêm 5 µl mỗi Index 1 primer (i7) - nắp cam vào mỗi hàng của VTA và 5 µl mỗi Index 2 primer (i5) - nắp trắng vào các cột của VTA. Bổ sung 15 µl Nextera PCR Master Mix vào mỗi giếng, hút nhả pipet 5 lần để trộn đều hoặc dùng máy vortex nhanh. Ly tâm đĩa ở tốc độ 280 g trong 1 phút ở nhiệt độ thường sau đó chuyển vào ủ trên máy PCR theo chu trình nhiệt dưới đây: 75 oC trong 3 phút, 95 oC trong 30 giây; 12 chu kì 95oC trong 10 giây, 55 oC trong 30 giây, 72 oC trong 30 giây; 72 oC trong 5 phút và giữ ở 4 oC.
Trong lúc đợi sản phẩm PCR, trộn đều dung dịch AMPure XP bead bằng máy vortex, sau đó thêm 45 µl Bead vào các giếng của plate mới chuẩn bị. Sau khi hoàn thành chu trình nhiệt, chuyển 45 µl sản phẩm PCR từ VTA sang đĩa đã chứa AMPure Bead. Lắc ở tốc độ 1800 rpm trong 2 phút sau đó ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm nhanh ở 280 g trong 1 phút và đặt lên giá từ trong vòng 2 phút. Dùng pipet loại bỏ dịch trong các giếng rồi thêm 200 µl cồn 80% vào các giếng. Để ủ 30 giây sau đó dùng pipet loại bỏ cồn trong các giếng. Lặp lại 1 lần bước rửa bằng cồn trên rồi giữ nguyên đĩa trên giá từ và để khô các hạt từ trong vòng 15 phút. Nhấc đĩa ra khỏi giá từ, thêm 50 µl Resuspension buffer vào các giếng. Lắc ở tốc độ 1800 rpm trong 2 phút rồi ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm nhanh đĩa mẫu ở 280 g trong 1 phút và đặt lên giá từ trong vòng 2 phút. Chuyển 45 µl dung dịch trong các giếng sang một đĩa mới chuẩn bị.
Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch LNB1 (Library Normalization beads 1))/LNA1 (Library Normalization Additives 1)):
Cho 24 mẫu: Sử dụng 1,1 ml LNA1 và 200µl LNB1 (đảm bảo rằng đã được trộn đều). Cho 12 mẫu: Sử dụng 550 µl LNA1 và 100 µl LNB1 (đảm bảo rằng đã được trộn đều). Chuyển 45 µl dung dịch LNA1/LNB1 vào mỗi giếng trên đĩa mới, kí hiệu LNP. Thêm 20 µl sản phẩm PCR đã tinh sạch vào các giếng đã chứa LNA1/LNB1 trên LNP. Đậy nắp đĩa và lắc ở 1800 rpm trong 30 phút rồi chuyển đĩa lên trên giá từ
trong 2 phút. Sau đó loại bỏ dịch nổi trong các giếng, nhấc plate ra khỏi giá từ và tiến hành bước rửa với LNW 1 (Library Normalization Wash 1):
- Thêm 45 µl LNW1 vào mỗi giếng đã chứa mẫu. Chú ý đổi đâu côn giữa các mẫu để tránh nhiễm chéo.
- Đậy nắp và lắc ở 1800 rpm trong 5 phút. Sau đó ly tâm nhanh ở 280 g - Đặt đĩa lên trên giá từ trong 2 phút. Loại bỏ dịch nổi trong các giếng
Nhấc đĩa ra khỏi giá từ ngay sau khi lặp lại bước rửa trên thêm 1 lần. Thêm 30 µl NaOH 0,1 N vào các giếng rồi đóng nắp giá và lắc ở 1800 rpm trong 5 phút. Sau đó ly tâm nhanh ở 280 g rồi ngay lập tức đặt đĩa lên trên giá từ trong 2 phút. Trong lúc ủ, chuẩn bị một plate mới; và thêm 25 µl LNS1(Library Normalization Storage Buffer 1) vào các giếng. Chuyển 25 µl dịch nổi từ giếng trên LNP sang đĩa mới đã chứa LNS1. Trộn đều và ly tâm ở 280 g trong 1 phút.