Nhiều giống Saintpaulia đã đƣợc nhân giống thƣơng mại và sự phát triển của các cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh đƣợc thu nhận nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng. Các cây con khỏe mạnh, sạch bệnh và giống nhau về mặt di truyền đã đƣợc lƣu trữ trong in vitro trong một thời gian dài (Jungnickel, Zaid, 1992).
Theo Bilkey và Cocking (1982), khả năng tái tạo khác nh u củ mô biểu bì và hạ bì ở Saintpaulia ionantha H. WendL. tùy thuộc vào môi trƣờng muối khoáng cơ bản đƣợc sử dụng trong nuôi cấy. Môi trƣờng chứa 0,1 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA cho sự tạo thành mô sẹo trên cuống lá cắt ngang còn nguyên lớp tế bào biểu bì và trên cuống lá bị tách bỏ lớp biểu bì (chỉ còn lớp các tế bào hạ bì). Sự tạo cây chỉ xảy ra trên cuống lá có chứa các lớp tế bào biểu bì. Trên môi trƣờng B5 với cùng nồng độ các chất điều hò sinh trƣởng đã diễn ra sự tạo chồi trên cả hai loại mẫu cấy. Khi trồng các cây thu đƣợc trên cả hai loại mô biểu bì và hạ bì đến khi ra hoa,các tác giả nhận thấy rằng, các cây thu đƣợc từ mô hạ bì khỏe mạnh hơn, lớn hơn về khối lƣợng tƣơi 25%, đƣờng kính lá lớn hơn 11%, nhiều lá hơn 28%, cuống lá mập hơn 14% và dài hơn 18% so với các cây thu từ các lớp tế bào biểu bì.
Theo Dallon (1987), từ lá, cuống lá và phần phát hoa của african violet có thể phát sinh tạo cơ qu n bình thƣờng và hoàn chỉnh trên môi trƣờng có 0,5 mg/l BA kết hợp với 0,5 mg/l NAA. Theo George (1993), việc nuôi cấy phát hoa in vitro của các cây african violet thể khảm đã tạo ra các cây con đồng kiểu gene với cây mẹ. Điều này có thể là do các chồi con đƣợc tạo ra từ đỉnh sinh trƣởng bên hoặc đỉnh sinh trƣờng củ phát ho đã biệt hóa thành chồi sinh dƣỡng. Chồi con african violet có thể nuôi cấy đƣợc trong môi trƣờng đơn giản gồm 23 g đƣờng, 240 ml nƣớc cất, 1 viên inositol 125 mg, 1 viên vitamin có chứa B1 và các khoáng tố, 4 muỗng nƣớc dừa và 1 viên vôi nhỏ để điều chỉnh pH. H koz ki (1993) đã nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng và pH môi trƣờng lên sự tạo mô sẹo, tái sinh và tăng trƣởng chồi từ lá african violet. Thời gian hình thành mô sẹo và chồi ngắn nhất trên môi trƣờng MS có chứ 30 g/l đƣờng, pH 5,8 và đây c ng là môi trƣờng cho chỉ số tái sinh chồi cao nhất. Shizuk Ohki (1993) đã qu n sát các th y đổi bề mặt mô học của
quá trình biệt hóa chồi từ lá cây african violet bằng kính hiển vi điện tử SEM (scanning electron microscopy). Trong nghiên cứu này, Ohki qu n sát động thái của các sự th y đổi ở các tế bào biểu bì của lá trong suốt quá trình nuôi cấy và xác định sự tồn tại của các loại tế bào đặc biệt mà chúng sẽ tạo ra chồi. Đồng thời c ng xác định nồng độ chất điều hò sinh trƣởng ảnh hƣởng đến sự tạo chồi trực tiếp không qua sự hình thành mô sẹo trên các giống đƣợc thử nghiệm.
Phạm Tấn Trƣờng và Võ Thị Bạch M i (2008) đã vào mẫu thành công cây
Saintpaulia spp. khi sử dụng Ca(ClO)2 10% trong 10 phút và c ng đạt kết quả
tƣơng tự khi dùng HgCl2 0,1% trong 5 phút; theo các tác giả, môi trƣờng 0,5 mg/l
IBA và 2,5 mg/l BA cho khả năng tái sinh chồi cao nhất và môi trƣờng chứa 0,5 mg/l IBA cho khả năng tạo rễ cao nhất.
Nguyễn Thị Kim Luyến và đồng tác giả (2008) cho rằng trong sự ra hoa của african violet, mô phân sinh ngọn ở nách lá hoạt động trở thành mô phân sinh hoa và cuối cùng thành nụ ho đầu tiên. Các nụ ho s u đó xuất hiện ở bên dƣới nụ hoa đầu tiên. C ng trong nghiên cứu này, các tác giả đã kết luận acid salicylic có khả năng cảm ứng sự chuyển mô phân sinh dinh dƣỡng thành mô phân sinh hoa. Bên
cạnh đó, nồng độ AgNO3 2,5x10-4 g/l giúp cho sự nở và ngăn cản sự héo sớm của
hoa african violet in vitro.
2.2. Sơ lƣợc về giai đoạn khử trùng trong vi nhân giống thực vật
Toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro luôn luôn đƣợc tiến hành trong điều kiện
vô trùng. Vì vậy, điều kiện vô trùng là một trong những yếu tố quan trọng nhất, quyết định sự thành bại của nuôi cấy in vitro. Phƣơng pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề mặt mô cấy.
Sơ đồ xử lý mẫu cấy ex vitro:
Mẫu cấy ex vitro
Rửa kỹ bằng xà phòng và nƣớc máy
Cho vào bình tam giác ngâm trong cồn 70oC
khoảng 20 – 60 giây
Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần
Tiếp tục lắc mẫu trong dung dịch diệt khuẩn 1 – 25% trong 5 – 15 phút với vài giọt Tween 80
Rửa bằng nƣớc cất vô trùng 5 – 6 lần
Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử
Mẫu cấy
Cấy lên môi trƣờng nuôi cấy
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình khử trùng mẫu cấy
Trong quá trình xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt nấm, khuẩn; các bộ phận có bám nhiều cát, bụi trƣớc khi xử lý cần rửa sạch bằng xà phòng và nƣớc máy. Sau khi xử lý xong, mô cấy đƣợc rửa sạch nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng, loại bỏ những phần bị dập trƣớc khi đặt mô cấy lên môi trƣờng nuôi cấy (Minh, 2004). Các chất kháng sinh ít đƣợc sử dụng vì tác dụng không triệt để và ảnh hƣởng xấu lên sự sinh trƣởng của mô cấy. Ngoài r , ngƣời ta còn sử dụng các chất làm giảm sức căng bề mặt nhƣ: Tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diệt nấm khuẩn. Street (1975) đã đƣ r khái niệm về nồng độ và thời gian sử dụng các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy nhƣ s u:
Bảng 2.1. Đánh giá hiệu quả về nồng độ và thời gian sử dụng của các tác nhân vô trùng
Tác nhân vô trùng Nồng độ Thời gian xử lý (phút)
Hypochlorite calcium [Ca(ClO)2] 9 – 10% 5 – 30
Hypochlorite sodium (NaClO) 2% 5 – 30
Hydroperoxid (H2O2) 10 – 12% 5 – 15
Nƣớc brom 1 – 2% 2 – 10
Mecury chloride (HgCl2) 0,1 – 1% 2 – 10
Chất kháng sinh 4 – 50 mg/l 30 – 60
2.3. Sơ lƣợc về các chất khử trùng sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật 2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2] 2.3.1. Calcium hypochlorite [Ca(ClO)2]
2.3.1.1. Giới thiệu
Ca(ClO)2 là một hợp chất thuộc nhóm chlorine, có màu trắng, dễ t n trong
nƣớc, giải phóng khí Cl2 làm cho nƣớc có mùi hắc đặc trƣng. Trong công nghệ hó
học: dùng trong nƣớc sơn, chất hò t n, chất tạo bọt, thuốc trừ sâu, hó chất chống đông,… Xử lý nƣớc sinh hoạt, nƣớc thải công nghiệp và khu đô thị. Trong thủy sản: tẩy trùng o, hồ, tr ng thiết bị, dụng cụ,… Diệt vi khuẩn, virus, tảo, vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc. Oxi hó các vật chất hữu cơ và mầm bệnh ngoại l i trong sản xuất
giống. Trong nuôi cấy mô thực vật: sử dụng nhƣ một chất để khử trùng khi đƣ các nguồn mẫu b n đầu từ môi trƣờng ex vitro chuyển s ng in vitro, nồng độ từ 5 – 10% trong khoảng từ 5 – 30 phút.
Ca(ClO)2 là chất oxi hó mạnh có tác dụng oxi hó vật chất hữu cơ sống trên
cơ thể sinh vật. Chúng tác động lên thành tế bào, hệ enzyme củ vi sinh vật tiếp xúc
với Ca(ClO)2 thì nguyên tử hydro trong cấu trúc phân tử đƣợc th y thế bởi Cl2, phá
hủy hệ enzyme củ vi khuẩn, gây chếtvi sinh vật.
2.3.1.2. Nhƣợc điểm
Ca(ClO)2 có tính ăn mòn c o và đây c ng chính là cơ chế diệt khuẩn của
chúng – ăn mòn màng tế bào; vì thế, chúng t không khó để gặp phải tình trạng mẫu cấy sống nhƣng bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm hay mẫu cấy không bị nhiễm khuẩn, không nhiễm nấm nhƣng lại chết hoặc không thể tái sinh; bởi vì các mô tế bào thực
vật rất dễ bị tổn thƣơng khi tiếp xúc với Ca(ClO)2 dẫn đến mẫu cấy sẽ khó tái sinh,
thời gian tái sinh kéo dài. Ngoài ra, ngộ độc có thể xảy r khi con ngƣời nuốt hay hít
phải Cl2 từ Ca(ClO)2. Cl2 sẽ phản ứng tạo ra HCl và HOCl gây độc đối với con
ngƣời (bỏng rát trong miệng, sƣng họng, đau họng, đau dạ dày, nôn mửa, tổn thƣơng hệ tuần hoàn,…) (WHO, 2000; Ines et al., 2013).
2.3.2. Mercury chloride (HgCl2) 2.3.2.1. Giới thiệu
Thủy ngân là một nguyên tố hó học trong bảng tuần hoàn có ký hiệu Hg (tiếng Hy Lạp hydr rgyrum, tức là thủy ngân) và số nguyên tử 80. Thủy ngân là một nguyên tố kim loại nặng tồn tại ở dạng lỏng, có ánh bạc trong nhiệt độ thƣờng. Thủy ngân đƣợc sử dụng trong các nhiệt kế, áp kế và các thiết bị kho học khác. Thủy ngân thu đƣợc chủ yếu bằng phƣơng pháp khử khoáng chất chu s (HgS).
Mercury chloride (HgCl2) là một dạng củ thủy ngân, hiện đƣợc sử dụng phổ
biến trong nhiều lĩnh vực nhƣng chủ yếu ở quy mô phòng thí nghiệm. Trong đầu thế kỷ 20, thủy ngân đƣợc cấp phát cho trẻ em hàng năm nhƣ là thuốc nhuận tràng và tẩy giun. Bột ngậm cho trẻ em và một số v cxin có chứ chất bảo quản thimerosal (một phần là etyl thủy ngân) kể từ những năm 1930. Mercury chloride còn là chất
tẩy trùng đối với các bác sĩ, bệnh nhân và thiết bị. Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, từ
năm 1994, Hussain và đồng tác giả đã thành công khi sử dụng HgCl2 nhƣ là một
chất giúp chống lại các vi khuẩn và nấm trong gi i đoạn vào mẫu b n đầu. Hiện
nay, HgCl2 thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 0,1 – 1% trong khoảng 2 – 10 phút cho
bƣớc khử trùng mẫu cấy (WHO, 2000).
2.3.2.2. Nhƣợc điểm
Thủy ngân nguyên tố lỏng ít độc, nhƣng các hợp chất và muối của nó lại rất độc, có thể gây tổn thƣơng não và g n khi con ngƣời tiếp xúc hay nuốt phải. Ngoài ra, thủy ngân còn dễ dàng hấp thụ qu d , các cơ qu n hô hấp và tiêu hóa. Các hợp chất vô cơ ít độc hơn so với hợp chất hữu cơ của thủy ngân. Cho dù ít độc hơn so với các hợp chất củ nó nhƣng thủy ngân vẫn tạo ra sự ô nhiễm đáng kể đối với môi trƣờng vì nó tạo ra các hợp chất hữu cơ trong các cơ thể sinh vật. Một trong những hợp chất độc nhất của nó là dimetyl thủy ngân, độc đến mức chỉ vài µl rơi vào d có thể gây tử vong.
Chứng bệnh min m t là một dạng ngộ độc thủy ngân. Thủy ngân tấn công hệ thần kinh trung ƣơng và hệ nội tiết, đồng thời ảnh hƣởng tới miệng, các cơ hàm mặt và răng. Sự phơi nhiễm kéo dài gây ra các tổn thƣơng não, gây tử vong, hoặc có thể gây ra các dị tật bẩm sinh ở thai nhi, mất khả năng điều hòa vận động, th y đổi tính cách, mất trí nhớ, mất ngủ, mệt mỏi, đ u đầu, giảm cân, căng thẳng tâm lý và viêm lợi (WHO, 2000).
2.3.3. Một số chất khử trùng khác 2.3.3.1. Hydro peroxide (H2O2)
Hydro peroxide (h y còn gọi là nƣớc oxi già) có công thức hó học H2O2.
Hydrogen peroxide là một chất oxi hó mạnh mẽ và đƣợc sử dụng nhƣ một chất tẩy
trắng và khử trùng. Tuy nhiên, H2O2 là chất oxi hóa mạnh có khả năng ăn mòn c o,
ảnh hƣởng đến mô biểu bì của thực vật trong quá trình khử trùng, do đó, áp suất thẩm thấu của mẫu cấy giảm nên mẫu khó mà hấp thu các chất dinh dƣỡng từ môi trƣờng nuôi cấy dẫn đến thời gian vào mẫu bị kéo dài. Mặc khác, hiện nay có khá nhiều vi khuẩn có khả năng tiết ra enzyme catalase, enzyme này có khả năng trung
hòa tác dụng diệt khuẩn của H2O2 nên khi sử dụng H2O2 để khử khuẩn thì tác dụng
không cao.H2O2 là chất oxi hóa mạnh có thể gây nổ và ảnh hƣởng đến sức khỏe con
ngƣời. (WHO, 2000).
2.3.3.2. Nƣớc brom
Brom là nguyên tố hó học thuộc nhóm h logen, có ký hiệu Br và số nguyên tử 35. Cả nhóm halogen thuộc nhóm VIIA trong bảng hệ thống tuần hoàn. Br có nguyên tử khối bằng 80. Brom c ng là một chất hóa học dùng để khử trùng, khi brom đƣợc thêm vào nƣớc nó tạo thành chất khử trùng và phản ứng với chất ô nhiễm trong nƣớc. Brom là một là một chất có khả năng b y hơi c o, mùi hắc khó chịu và đƣợc đánh giá là khá độc. Hơi brom gây kích ứng niêm mạc, chảy nƣớc mắt, ho, suyễn, chóng mặt, đ u đầu, đ u bụng, chảy máu m i, gây mất trí nhớ, rối loạn tâm thần,… (WHO, 2000).
2.3.3.3. Các chất kháng sinh
Kháng sinh h y còn gọi là trụ sinh, kháng khuẩn đƣợc sử dụng phổ biến (Ampicillin, Penicillin, Amoxillin, Streptomycin, P romycin,…) trong nuôi cấy mô thực vật nhằm ngăn chặn sự phát sinh hoặc tiêu diệt sự phát triển củ khuẩn, nấm mốc. Tuy nhiên, kháng sinh lại gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe con ngƣời là: gây khó khăn cho chẩn đoán; tiêu diệt các vi khuẩn có lợi; gây kháng thuốc; một số loại kháng sinh gây dị ứng, suy tủy và các bệnh khác nhƣ điếc, suy gan hay suy thận,… Trong nuôi cấy mô thực vật thì kháng sinh đƣợc dùng để diệt hoặc ức chế các nguồn nhiễm từ môi trƣờng ex vitro, tuy nhiên kháng sinh có khả năng hấp thụ
qua da, niêm mạc và có khả năng khuếch tán trong không khí (Ines et al., 2013),
nên việc sử dụng kháng sinh trong khử trùng mẫu là điều không đƣợc khuyến khích.
2.3. Sơ lƣợc về nano bạc 2.3.1. Nano bạc 2.3.1. Nano bạc
2.3.1.1. Giới thiệu về bạc kim loại và cơ chế kháng khuẩn của bạc
Bạc và các hợp chất của bạc thể hiện tính độc đối với vi khuẩn, virus, tảo và nấm; tuy nhiên, bạc khác với các kim loại nặng khác (chì, thủy ngân,…), vì bạc không thể hiện tính độc với con ngƣời. Từ x xƣ , ngƣời t đã sử dụng đặc tính này
của bạc để phòng bệnh. Ngƣời cổ đại sử dụng các bình bằng bạc để lƣu trữ nƣớc, rƣợu dấm. Trong thế kỷ 20, ngƣời t thƣờng đặt một đồng bạc trong chai sữ để kéo dài độ tƣơi của sữa. Bạc và các hợp chất của bạc đƣợc sử dụng rộng rãi từ đầu thế kỷ XIX đến giữa thế kỷ XX để điều trị các vết bỏng và khử trùng (Siddhartha et al., 2007).
Các đặc tính kháng khuẩn của bạc bắt nguồn từ tính chất hóa học của các ion
Ag+. Ion này có khả năng liên kết mạnh với peptidoglycan, thành phần cấu tạo nên
thành tế bào của vi khuẩn và ức chế khả năng vận chuyển oxi vào bên trong tế bào dẫn đến làm tê liệt vi khuẩn. Nếu các ion bạc đƣợc lấy ra khỏi tế bào ng y s u đó, khả năng hoạt động của vi khuẩn lại có thể đƣợc phục hồi. Cấu trúc tế bào củ động vật không có thành tế bào, nên ion bạc không thể gây tổn thƣơng cho con ngƣời hay động vật (Siddhartha et al., 2007).
Có một cơ chế tác động của các ion bạc lên vi khuẩn đáng chú ý đƣợc mô tả
nhƣ s u: sau khi Ag+
tác động lên lớp màng bảo vệ của tế bào vi khuẩn gây bệnh nó sẽ đi vào bên trong tế bào và phản ứng với nhóm sulfhydryl – SH của phân tử enzyme chuyển hóa oxi và vô hiệu hóa men này dẫn đến ức chế quá trình hô hấp của tế bào vi khuẩn. Ngoài ra, các ion bạc còn có khả năng liên kết với các base của DNA và trung hò điện tích của gốc phosph te do đó ngăn chặn quá trình sao chép DNA. Sau khi thuốc kháng sinh đƣợc phát minh và đƣ vào ứng dụng với hiệu quả c o ngƣời t không còn qu n tâm đến tác dụng kháng khuẩn của bạc nữa. Tuy nhiên, từ những năm gần đây, do hiện tƣợng các chủng vi sinh ngày càng trở nên kháng thuốc, sự quan tâm trở lại đối với việc ứng dụng khả năng diệt khuẩn hay các ứng dụng khác của bạc đã qu y trở lại, đặc biệt là dƣới dạng hạt có kích thƣớc nano (Siddhartha et al., 2007).
2.3.1.2. Ƣu điểm của nano bạc
Hạt nano bạc là các hạt bạc có kích thƣớc từ 1 nm đến 100 nm. Các hạt nano