Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.4. Tình hình nghiên cứu kỹ thuật bảo tồn tinh dịch gà đông tảo trong và ngoà
2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
ClacK.E and Sarakoonk (1967) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường xung quang đến khả năng sinh sản của gà trống và gà mái.
Các tác giả còn nghiên cứu ảnh hưởng của số lượng tinh trùng cho một lần dẫn tinh đến tỷ lệ trứng có phôi ở gà Tây (Lake, 1971). Những ảnh hưởng của nhiệt độ bảo tồn tinh dịch trong các môi trường đến kết quả thụ tinh nhân tạo. Kết quả cho thấy bảo tồn tinh dịch gà ở 5oC và gà Tây ở 5 - 10oC cho kết quả tốt (Lake and Ravie, 1979).
Một số tác giả đã nghiên cứu môi trường và kỹ thuật đông lạnh tinh dịch gà, bảo quản ở -196oC và những nhân tố ảnh hưởng đến kết quả đông lạnh (Sexton, 1980).
nhau cho thấy sử dụng dimethyl formamide làm chất chống đông với tốc độ đông lạnh 30oC/ phút thu được tinh trùng có tỷ lệ thụ thai cao nhất (70%) sau khi giải đông. Tinh trùng sau khi giải đông được thụ tinh nhân tạo theo quy trình thụ tinh hai ngày liên tiếp ở tuần thứ nhất và thụ tinh nhắc lại một lần ở tuần tiếp theo (Seigneurin F1 et al., 2013).
Kết quả so sánh phương pháp bảo tồn nuôi một quần thể gà trong 20 năm với phương pháp bảo quản lạnh cho thấy phương pháp nuôi một quần thể cần chi phí ít hơn nếu bảo tồn trong thời gian là 3 năm đầu. Nếu bảo tồn lâu hơn thì phương pháp bảo quản lạnh có hiệu quả chi phí tốt hơn (Silversides et al., 2012).
Kết quả nghiên cứu sử dụng glycerol, dimethylsulfoxide (DMSO), và dimethylacetamide (DMA) làm chất chống đông cho thấy dùng DMA sản xuất tinh viên đông lạnh cho tỷ lệ thụ thai cao nhất (92,7% nếu đông lạnh ở -6oC và 84,7% ở 5oC). Nếu sản xuất tinh cọng rạ thì dùng glycerol cho tỷ lệ thụ thai cao nhất (53,7% và 63,9% nếu cân bằng trong 1 hoặc 30 phút (Tselutin et al., 1999).
Kết quả sử dụng glycerol với các nồng độ khác nhau (4, 6, 7 và 8%) làm chất chống đông để sản xuất tinh đông lạnh cho gà, cho thấy nồng độ glycerol 8% cho chất lượng tốt nhất (tổng số 67% tinh trùng vận động và 66% tinh trùng sống sau giải đông), nồng độ glycerol 4% có chất lượng kém nhất (38% tinh trùng vận động và 49% tinh trùng sống). Tuy nhiên, tỷ lệ thụ thai của tất cả các nồng độ glycerol lại tương tự như nhau (23 - 30% trứng được thụ thai) (Blanch et al., 2014).
Tần số khai thác tinh có ảnh hưởng đến chất lượng tinh gà. Kết quả thí nghiệm khai thác tinh gà với tần số khác nhau: 2 lần/ ngày (12 giờ), 1 lần/ ngày (24 giờ) và 2 ngày một lần (48 giờ) cho thấy thể tích tinh khai thác với tần số 12 giờ thấp hơn so với 24 giờ. Số lượng tinh trùng khai thác với tần số 24 giờ và 48 giờ (1.7 ± 0.2, 1.8 ± 0.2 x 109), cao hơn so với 12 giờ (1.2 ± 0.1 x 109) (Riaz et al., 2004).
Nồng độ chất chống đông và phương pháp chống đông có ảnh hưởng lên chất lượng tinh đông lạnh. Nếu dùng dimethylacetamide (DMA) với nồng độ 6% làm chất chống đông thì không có sự khác biệt về tỷ lệ sống và tỷ lệ thụ thai của tinh sau khi giải đông (10,8 và 12,8%) giữa phương pháp sản xuất tinh đông viên hay cọng rạ. Dùng glycerol nồng độ 11% thì tỷ lệ sống và vận động của tinh trùng cọng rạ cao hơn viên đông lạnh. Tuy nhiên, tỷ lệ thụ thai của cả hai phương
pháp đông lạnh đều rất thấp (2,1% của tinh cọng rạ và 4,2% của tinh đông viên). Nếu dùng chất chống đông với liều thấp hơn thì glycerol 8% sản xuất tinh cọng rạ có tỷ lệ tinh trùng sống và vận động cao hơn so với dùng DMA 3% để sản xuất tinh đông viên. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ thụ thai trong việc sử dụng hai chất chống đông trên (28,8% nếu dùng glycerol và 25% nếu dùng DMA) (Abouelezz et al., 2015).
Khả năng hoạt động của tinh trùng tỷ lệ thuận với nhiệt độ. Nhiệt độ ở 5oC tinh trùng hầu như không hoạt động và chúng hoạt động ở mức tối đa 38 - 41oC. Ở 0oC và 46oC tinh trùng sẽ chết (0oC nước nội bào và ngoại bào sẽ đóng băng, ở 46oC protein của tinh trùng bị biến tính và không có khả năng hồi phục được). Nếu được bảo tồn bằng các kỹ thuật đặc biệt như kỹ thuật đông lạnh, tinh trùng có thể sống trong khoảng thời gian khá dài. Theo Majua (1989) dùng phương pháp bức xạ dự toán, tinh trùng bảo tồn ở nhiệt độ -196oC có thể bảo tồn được 400 năm (trạng thái tiềm sinh).
Trên đối tượng gia cầm và gà nói riêng, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu có tính chất tiền đề và nền tảng cho việc xây dựng các quy trình đông lạnh tinh trùng gà ứng dụng trong sản xuất. Trong đó, gà là một trong những loài động vật đầu tiên được nghiên cứu quy trình đông lạnh của chúng và thế hệ gà con đầu tiên được sinh ra nhờ kỹ thuật phối tinh nhân tạo bằng sử dụng tinh trùng đông lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng đã được thực hiện. (Shaffner et al., 1941)
Tuy nhiên, chất lượng tinh trùng gà sau đông lạnh (sự nguyên vẹn của màng tế bào sau đông lạnh, giải đông) cũng như hiệu quả của việc phối tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh chịu ảnh hưởng rất nhiều của các thành phần và hàm lượng của các thành phần trong môi trường đông lạnh, bởi lượng tinh trùng có trong một liều phối và bởi quy trình và phương thức hạ nhiệt để đưa tinh trùng lạnh sâu vào nitơ lỏng và sau đó là quy trình giải đông.
Trong đó, các chất chống choáng lạnh như glycerol, ethylene glycol… Glycerol đã được sử dụng thành công với vai trò là chất chống choáng lạnh cho tế bào tinh trùng trong quá trình bảo quản đông lạnh (Pogle et al., 1949). Sau đó glucerol được sử dụng như một loại chất chống choáng lạnh phổ biến nhất trong bảo quản đông lạnh tinh trùng gà ứng dụng trong sản xuất (Davis, 1963; Foote, 1998). Tuy nhiên glycerol lại có ảnh hưởng không tốt tới hiệu quả thụ tinh của tinh trùng gà sau khi được dẫn tinh vào đường sinh dục gà mái, vì vậy, cần có
biện pháp để làm giảm hàm lượng glycerol xuống dưới 1% (thể tích: thể tích) trước khi tiến hành phối tinh nhân tạo (Lake, 1986; Hammerstedt and Graham, 1992). Gần đây, trong một số nghiên cứu công bố 3 phương pháp khác nhau nhằm là giảm hàm lượng glycerol ra khỏi mẫu tinh trước khi phối tinh nhân tạo: một là ly tâm qua cột gradien tỷ trọng, hai là phương pháp thẩm tách (tương tự phương pháp swim- up- tinh bơi ngược) và ba là phương pháp pha loãng kết hợp nhiều bước kết hợp ly tâm loại bỏ dung dịch đông lạnh của mẫu tinh sau giải đông (Long và cs., 2004; Lake, 1986; Tajima et al.,1989; Phillips et al.,1996). Tất cả những phương pháp này đều có thể gây ảnh hưởng bất lợi đến tinh trùng gà và hạn chế áp dụng trong sản xuất vì với lý do chỉ thực hiện với nhiều thiết bị phòng thí nghiệm (Lake et al., 1984; Phillip et al., 1996; Purdy et al., 2009).
Bên cạnh đó, các bước hạ nhiệt tới đông lạnh tinh trùng gây ảnh hưởng làm tính ổn định và tổn thương cấu trúc của màng tế bào (Amann and Pickett, 1987). Màng tế bào tinh trùng chứa hàm lượng cao cholesterol và các loại lipid không no là những thành phần dễ chịu ảnh hưởng bởi quá trình này và mất khả năng bảo vệ sự ổn định cấu trúc của màng tế bào trong quá trình hạ nhiệt tới đông lạnh (Parks and Lynch, 1992). Các kỹ thuật mới được nghiên cứu thử nghiệm nhằm khắc phục hiện tượng này bằng cách hợp nhất các phân tử Cholesterol và lipid không no vào màng tế bào tinh trùng giúp làm tăng rõ rệt sức sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh (Purdy and Graham, 2004; Moore et al., 2005).
Môi trường mà tinh trùng tồn tại trong đó sau khi xuất ra ngoài cơ thể đóng vai trò quan trọng với sức sống của chúng (Wishart, 1989). Đã có nhiều công thức môi trường đông lạnh tinh trùng gà khác nhau đã được nghiên cứu, sử dụng và ứng với mỗi môi trường đông lạnh đòi hỏi một quy trình đông lạnh tương ứng bao gồm quy trình hạ nhiệt, kích thước của cọng rạ và nồng độ tinh trùng (Lake and Stewart, 1978; Chaudhuri and Lake, 1988; Tajima et al., 1989; Sasaki et al., 2010).
Tốc độ hạ nhiệt có liên quan chặt chẽ tới mức độ tổn thương của cấu trúc màng tế bào tinh trùng do nó liên quan đến phản ứng của tế bào tinh trùng đối với sự thay đổi áp lực thẩm thấu tác động lên tế bào (Oldenhof et al., 2012). Để đảm bảo hiệu quả đông lạnh, tinh trùng cần được làm lạnh từ từ đủ chậm để tạo nên sự cân bằng giữa chất chống choáng lạnh và nước giữa 2 phía của màng tế bào tinh trùng trong quá trình hạ nhiệt (Hammerstedt et al., 1990). Nhờ đó giúp giảm thiểu sự tổn thương màng tế bào tinh trùng (Amann and Pickett, 1987).
Các quy trình đông lạnh tinh động vật được áp dụng phổ biến trên thế giới:
Hiện nay, song song tồn tại 2 phương pháp làm tinh đông lạnh: Phương pháp tạo tinh viên bằng thủ công và phương pháp sản xuất tinh cọng rạ theo quy trình mới dựa trên sự giúp đỡ của các phương tiện kỹ thuật hiện đại (hệ thống đông lạnh chậm theo chương trình). Việc làm tinh đông lạnh được tiến hành với nhiều dạng: viên, cọng rạ, ampul, nang…Với những tinh dịch có nhiều tinh thanh như lợn, ngựa…cần được ly tâm, tách bớt nước trước khi bảo tồn, còn những tinh dịch có ít tinh thanh như trâu bò, dê, cừu, gia cầm…không cần ly tâm.
Pha loãng tinh dịch
- Điều chế môi trường pha loãng: có 2 phương pháp pha loãng:
- Pha loãng 1 lần: toàn bộ môi trường được pha toàn bộ vào trong tinh dịch. - Pha loãng 2 lần:
+ Lần 1: Pha 1/2 lượng môi trường (có lòng đỏ trứng) với toàn bộ dung dịch + Lần 2: Sau khi cân bằng nhiệt độ, pha tiếp 1/2 lượng môi trường còn lại (có chứa glycerol hoặc chất chống choáng lạnh khác.
- Lượng chất chống choáng lạnh: Tùy theo loại chất chống choáng lạnh và tùy theo từng loại môi trường (4 - 14%).
Trình tự và thời gian cân bằng nhiệt
- Cân bằng nhiệt độ có thể tiến hành trước khi tạo viên hay nạp cọng rạ, nhưng cũng có thể tiến hành sau khi nạp cọng rạ.
- Thời gian cân bằng nhiệt độ theo đa số các tác giả là 3 - 4 giờ. Trong những năm gần đây, một số tác giả đã tiến hành cân bằng nhiệt độ trong thời gian 30 - 40 phút.
Nạp tinh vào cọng rạ Có 2 cách nạp tinh dịch:
- Cách thủ công: dùng sáp dẻo hoặc viên bi để bịt đầu cọng rạ.
- Cách tự động: sau khi nạp xongtinh dịchvào cọng rạ, máy tự động kẹp bẹp đầu cọng rạ.
- In nhãn hiệu: Máy tự động in trên cọng rạ trước hoặc sau khi nạp tinh. - Kỹ thuật tạo viên tinh bằng phương pháp thủ công
- Nhúng ngập một tấm mịch có kích cỡ 20 x 30 x 1,0cm, phẳng hoặc có các lỗ có đường kính 0,2 - 0,3cm vào trong khay chứa nitơ lỏng trong 10 phút.
- Dùng kẹp gắp miếng mịch đặt trên mặt nitơ lỏng.
- Dùng ống hút nhỏ hút tinh dịch đã cân bằng nhỏ vào các lỗ, hốc trên tấm mịch, mỗi giọt 0,2 - 0,3ml (nếu tấm miền không khoét lỗ, nhỏ tinh dịch trên mặt phẳng tấm mịch, giữ cho tinh dịch có hình cầu). Do gặp lạnh, giọt tinh dịch sẽ đông lại và có màu trắng sau 1-2 phút.
- Nhúng ngập tấm mịch chứa viên tinh vào khay chứa nitơ lỏng trong thời gian 1-2 phút.
- Nhấc tấm mịch ra và dồn các viên tinh vào giỏ (hoặc cóng đựng) đã ghi số hiệu.
- Gắp một vài viên tinh để kiểm tra hoạt lực của tinh trùng sau đông lạnh. - Nhúng ngập các giỏ đựng viên tinh vào bình chứa đầy nitơ lỏng để bảo tồn.
Kỹ thuật sản xuất tinh cọng rạ theo phương pháp tự động:
Sau khi tinh nguyên được đánh giá đạt yêu cầu cho đông lạnh, cần pha loãng ngay theo hướng dẫn của máy so màu tự động. Tùy theo loài động vật để dùng môi trường pha loãng cho phù hợp. Sau khi pha loãng tiến hành các bước tiếp theo:
Nạp tinh dịch đã pha vào cọng rạ (0,25ml), do máy tự động nạp. Kẹp đầu ống và in số hiệu lên cọng rạ (do kỹ thuật viên đặt chương trình cho bộ phận in gắn liền với máy nạp tinh).
- Xếp những cọng rạ đã có tinh dịch lên giá chuyên dùng để chuẩn bị cân bằng nhiệt độ.
- Cho các giá trên vào ngăn kín có nhiệt độ thích hợp để cân bằng nhiệt độ trong 3,5 giờ.
- Làm lạnh tinh trong cọng rạ: Xả khí nitơ vào ngăn lạnh của máy đông lạnh (có quạt thổi cho hơi lạnh tỏa đều ngăn này). Khi nhiệt độ hạ xuống -110oC, cho các giá chứa cọng rạ đã được cân bằng đủ thời gian vào ngăn làm lạnh - 110oC và duy trì ở nhiệt độ này ở 5 - 7 phút, sau đó xả tiếp nitơ vào ngăn làm lạnh để hạ nhiệt độ xuống -120oC trong thời gian 3 phút.
- Làm đông lạnh: Đổ nitơ lỏng vào ngăn bên cạnh máy làm lạnh. Sau khi các giá đạt nhiệt độ -120oC trong thời gian 3 phút thì dồn ngay các cọng rạ vào ngăn nitơ lỏng và duy trì trong thời gian 5 phút.
- Bảo tồn: Vớt nhanh cọng rạ trong ô đông lạnh cho vào các cóng, giỏ và bảo tồn trong bình nitơ lỏng. Trong quá trình bảo tồn cầnkiểm tra chất lượng tinh để có quyết định phù hợp.