Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Phương pháp pha loãng bảo tồn tinh dịch gà đông tảo
Dùng 2 môi trường pha loãng tinh dịch gà:
Môi trường 1 (MTPL 1)
Glycocol: 5,25g
Sodium chloride (NaCl): 5,8g Potasium chloride: 1,33g Nước cất: vừa đủ 1000ml
Sodium chloride (NaCl): 6,8g Potasium chloride: 1,733g Calcium chloride: 0,642g Magnesium sulphate: 0,25g Sodium bicarbonate: 2,45g Nước cất: vừa đủ 1000ml
Chuẩn bị môi trường:
Hóa chất được sử dụng trong môi trường phải đảm bảo đúng tiêu chuẩn và được cân bằng cân điện tử có độ chính xác 0,001mg.
Nước cất 2 lần hấp cách thủy trong 30 phút.
Quy trình kỹ thuật pha loãng và bảo tồn tinh dịch gà
Bước 1
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất và pha môi trường bảo quản. - Dụng cụ
Các dụng cụ cần thiết gồm: dụng cụ pha môi trường, thu nhận tinh dịch, kiểm tra tinh dịch.
Dụng cụ pha môi trường: các ống đong, bình tam giác có thể tích tương ứng với lượng môi trường cần pha, đũa thuỷ tinh.
Dụng cụ thu nhận tinh dịch: cốc hứng tinh, các lọ thu mẫu bằng thuỷ tinh có thể tích 20 - 30ml, các pipet pasteur nhựa, pipet thuỷ tinh 5ml, nhiệt kế có thang đo 100oC.
Dụng cụ kiểm tra tinh dịch: kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 đến 1000 lần, lam kính, lamen, bộ đếm hồng cầu, các ống eppendorf 1,5ml.
Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất sau đó bằng cồn, và sấy khô. Các dụng cụ bằng nhựa được rửa sạch, tráng bằng nước cất và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên.
- Hoá chất
Glycocol, Sodium chloride,Potasium chloride, nước cất hai lần, eosin 5%, dung dịch nước muối sinh lý 0,85%, dung dịch nước muối 3%, cồn sát trùng 70%.
Chuẩn bị môi trường pha loãng:
Môi trường pha loãng có các thành phần gồm: Glycocol 5,25g, Sodium chloride 4,6g, Potasium chloride 1,28g; nước cất hai lần đủ 1000 ml.
Đun 1000ml nước cất 2 lần đến nhiệt độ sôi. Sau đó lần lượt hòa tan: Glycocol, Sodium chloride, Potasium chloridevào một phần nước. Bổ sung nước sao cho vừa đủ 1000 ml, sau đó đưa lên máy khuấy từ khuấy đều trong 30 phút.
Bước 2
Thu nhận tinh dịch
Tinh dịch gà được khai thác theo phương pháp massage: Một người kẹp gà trống vào nách phía bên trái sao cho phần đuôi gà hướng về phía trước. Tay trái người này giữ hai chân gà, tay phải vuốt nhẹbụng gà trống xuôi xuống phía đuôi. Khi thấy gà trống đã hưng phấn thì tay phải nhẹ nhàng ép miệng lỗ huyệt. Cùng lúc đó người thứ hai có thể vừa vuốt ngược đuôi gà lên phía trên để lộ lỗ huyệt tạo điều kiện lấy tinh được dễ dàng và vừa hứng tinh.
Bước 3
Kiểm tra tinh dịch
Ngay sau khi thu nhận, tinh dịch được ghi lại thể tích trên cốc hứng tinh, chuyển tinh dịch vào cốc đựng mẫu, đưa cốc đựng tinh dịch vào cùng bể nước ấm (25-35oC) với môi trường. Kiểm tra ngay pH của tinh dịch bằng giấy đo pH.
Kiểm tra xác định hoạt lực tinh trùng: một giọt tinh dịch được lấy ra và nhỏ lên lam kính, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi kiểm tra ở độ phóng đại 100 hoặc 400 lần. Hoạt lực được đánh giá theo phần trăm, với thang điểm 100%.
Kiểm tra xác định nồng độ tinh trùng: tinh dịch được pha loãng 200 lần với dung dịch NaCl 3% bằng ống trộn hồng cầu và được đếm ngay, sử dụng buồng đếm Newbouer.
Kiểm tra xác định tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: một giọt tinh dịch được nhuộm bằng thuốc nhuộm eosin, làm tiêu bản quét. Tỷ lệ tinh trùng sống được đếm ngay lập tức trong vòng 1- 2 phút sau khi nhuộm, đếm tối thiểu 200 tinh trùng có trên tiêu bản. Sau 2 phút, không nên đếm tiếp vì có thể sẽ không còn chính xác. Tiêu bản kỳ hình được làm cùng với tiêu bản sống chết, nhưng được để lại kiểm tra trong thời gian ủ mẫu ở 5oC.
Tinh dịch cần đảm bảo đủ tiêu chuẩn để pha loãng: hoạt lực tinh trùng ≥70%; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ≤20%; tỷ lệ tinh trùng sống ≥ 80%
Bước 4
Pha loãng tinh dịch với môi trường
Môi trường và tinh dịch được ủ trong cùng bể nước (25-350C). Khi pha môi trường nên rót môi trường chảy từ từ theo thành cốc đựng mẫu và lắc nhẹ cốc để tinh dịch hoà lẫn vào môi trường một cách từ từ. Tỷ lệ pha loãng là 1:1 hoặc 1:2 (thể tích tinh dịch: thể tích môi trường).
Bước 5
Bảo quản tinh dịch gà Đông Tảo
Cốc chứa tinh dịch đã pha loãng được đặt vào trong một cốc khác có chứa nước ấm được lấy từ chính bể cân bằng tinh dịch và được chuyển vào bảo quản ở 5oC.
Bước 6
Kiểm tra chất lượng tinh dịch
Tinh dịch gà Đông Tảo bảo quản ở 5oC được kiểm trachất lượng trước khi sử dụng.
Các chỉ tiêu kiểm tra: Hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình…
3.3.4. Phương pháp đông lạnh tinh dịch gà Đông Tảo ở -196oC Môi trường đông lạnh 1 (MTĐL 1)
Sodium - L - glutamate: 19,2g D- Fructose: 8g Magnessium acetate: 0,7g Potassium acetate: 5g Polyvinylpyrrolidone 10: 3g Nước cất: 1000ml pH: 6,95 Áp lực thẩm thấu: 340mOsmol/kg
Môi trường đông lạnh 2 (MTĐL 2)
Sodium - L - glutamate: 8,07g Fructose: 5g
Magnesium chloride anhydrous: 0,34g
Potassium phosphate dibasic trihydrate: 12,7g Potassium phosphate monobasic: 0,65g
TES: 3,95g
Sodium acetate trihydrate: 4,3g
Chất bảo vệ lạnh: Glycerol (Gly) hoặc Dimethyl sulfoxide (DMSO).
Pha môi trường đông lạnh:
Dùng nước cất hai lần đã đun sôi cách thủy pha với lượng hóa chất của từng môi trường, dùng đũa thủy tinh khuấy đều, điền đủ lượng nước cất vừa đủ, môi trường được khuấy đều trong vòng 30 phút. Chia lượng môi trường thành 02 phần bằng nhau. Một phần môi trường được bổ sung glycerol hoặc Dimethyl sulfoxide hoặc lòng đỏ trứng gà và tiếp tục khuấy đều 30 phút (môi trường 2); phần không có glycerol hoặc Dimethyl sulfoxide hoặc lòng đỏ trứng gà (môi trường 1). Môi trường bảo quản ở 4oC - 5oC.
Các bước pha loãng và đông lạnh tinh dịch:
Bước 1
Tinh dịch pha loãng với MTĐL 1 (không có Glycerol) theo tỷ lệ 1:1 (thể tích tinh dịch: thể tích môi trường). Ủ hỗn hợp tinh dịch ở nhiệt độ 5oC trong 30 phút.
Bước 2
Bổ sung MTĐL 2 (có Glycerol) có thể tích bằng MTĐL 1 vào hỗn hợp tinh dịch đã ủ. Cân bằng hỗn hợp tinh dịch ở 5oC trong 01 giờ.
Bước 3
Nạp hỗn hợp tinh dịch vào cọng rạ có thể tích 0,5ml. Ủ hỗn hợp tinh dịch ở nhiệt độ 5oC trong 30 phút.
Đông lạnh tinh cọng rạ: Tinh cọng rạ sau khi ủ được đưa vào buồng đông lạnh tinh dịch, thử nghiệm 02 mức nhiệt độ đông lạnh là hạ nhiệt độ buồng đông lạnh xuống -130oC và -165oC.
Nhúng tinh cọng rạ ngập vào Nitơ lỏng -196oC.
3.3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu được được xử lý trên máy tính nhờ các chương trình Excel, Minitab 16.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HỌC TINH DỊCH CỦA GÀ
Nghiên cứu tinh dịch của 15 gà trống Đông Tảo nuôi tại các hộ chăn nuôi tham gia đề tài. Gà trống có ngoại hình đặc trưng của gà Đông Tảo, sức khỏe tốt, được huấn luyện thành thục, lượng tinh dịch khai thác ổn định. Khi khai thác, nếu tinh dịch của gà trống bị lẫn phân sẽ được loại bỏ.
Nghiên cứu đánh giá một số chỉ tiêu: thể tích tinh dịch, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình. Kết quả về phẩm chất tinh dịch gà Đông Tảo được trình bày ở bảng 1.
Bảng 4.1. Kết quả một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch của gà Đông Tảo
Mã số gà Số mẫu (n) Thể tích (ml) Hoạt lực (A%) Nồng độ (tỷ/ml) Tỷ lệ tinh trùng sống (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (%) 01 30 0,38±0,02 75,15±2,25 4,12±0,01 82,12±3,35 11,25±1,12 02 30 0,41±0,03 76,19±2,15 3,68±0,02 80,15±1,60 10,20±2,10 03 30 0,35±0,02 74,12±4,34 2,57±0,01 81,25±2,12 12,12±1,15 04 28 0,44±0,02 80,33±5,05 2,16±0,01 85,11±1,25 13,10±1,31 05 29 0,55±0,01 77,22±6,15 4,02±0,03 82,12±1,10 10,20±3,14 06 29 0,48±0,03 80,12±4,20 3,12±0,01 83,20±2,02 12,25±2,12 07 27 0,39±0,01 78,15±2,10 3,52±0,02 82,96±1,92 13,67±3,16 08 28 0,51±0,02 76,34±2,51 2,68±0,03 81,21±1,83 15,55±1,10 09 30 0,59±0,01 75,51±2,20 3,55±0,02 81,10±2,13 11,23±1,13 10 29 0,46±0,01 75,27±1,15 2,17±0,03 80,12±3,04 13,35±1,05 11 29 0,35±0,02 79,27±4,34 3,12±0,01 83,12±1,10 10,20±3,14 12 26 0,44±0,02 75,33±5,05 3,52±0,02 80,20±2,02 12,25±2,12 13 28 0,48±0,03 77,22±6,15 2,68±0,03 86,96±1,92 13,67±3,16 14 27 0,39±0,01 73,92±4,20 3,12±0,01 80,15±1,60 12,12±1,15 15 30 0,39±0,01 76,15±2,10 3,68±0,02 85,25±2,12 13,10±1,31 TB 0,44±0,02 76,69±3,60 3,18±0,02 82,33±1,94 12,28±1,89
Chỉ tiêu thể tích tinh dịch một lần lấy tinh là chỉ tiêu quan trọng, đánh giá phẩm chất tinh dịch. Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào các yếu tố và có độ biến động lớn. Những nhân tố ảnh hưởng đến chỉ tiêu này như giống, thức ăn, trạng thái sức khỏe, rõ rệt nhất là kỹ thuật lấy tinh. Do cấu tạo của cơ quan sinh dục gà trống không có dương vật, không thể dùng âm đạo giả và các dụng cụ đặc biệt để lấy tinh, do vậy việc luyện lấy tinh và kỹ thuật lấy tinh có ảnh hưởng rất lớn đến lượng xuất tinh.
Bảng 4.1 cho thấy: thể tích tinh dịch trung bình của gà trống Đông Tảo là 0,44ml. Tác giả Dương Đình Long (1978 - 1979) cho kết quả thể tích tinh dịch của một số giống gà: gà Rhode (0,89 ml), gà Hồ (0,85 ml),và gà Ri (0,53 ml), gà Sussex (0,45 ml).
Tác giả Trịnh Văn Thân (1996) nghiên cứu tinh dịch một số giống gà cho kết quả thể tích tinh dịch các giống Rhode-Ri, HBX, Hybro, Leghorn, AA, Plymouth lần lượt là: 0,3ml; 0,55ml; 0,53ml; 0,35ml; 0,5ml; 0,32ml.Christopher (1995) lấy tinh ở gà Broiler có kết quả là 0,53 - 0,56ml.
Bahr and Bakst cho rằng lượng xuất tinh trung bình của gà trong một lần lấy tinh là 0,25ml.
Như vậy, thể tích tinh dịch của gà Đông Tảo tương đương một số giống gà khác. Thể tích tinh dịch khác nhau ở các nghiên cứu, vì chỉ tiêu này phụ thuộc vào các yếu tố như: giống gà, độ tuổi khai thác, kỹ thuật khai thác …
Chỉ tiêu về hoạt lực tinh trùng là một trong những chỉ tiêu rất quan trọng, nó đánh giá sức sống của tinh trùng trong tinh dịch và nó quyết định đến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng, chỉ tiêu này càng lớn thì chất lượng tinh trùng càng cao. Trung bình hoạt lực tinh trùng đạt từ 70% - 90%. Nếu hoạt lực đạt dưới 70% thì chất lượng tinh dịch kém, nếu hoạt lực tinh trùng đạt dưới 50% thì phải loại bỏ.
Theo nghiên cứu của Trịnh Văn Thân (1996), hoạt lực tinh trùng của một số giống gà là: Rhode-Ri (75%), Hybro (73%), Leghorn (70%), AA (84%), Plymouth (70%).
Hoạt lực tinh trùng trung bình của gà Đông Tảo là 76,69% cao hơn so với hoạt lực tinh trùng các giống gà Rhode-Ri, Hybro, Leghorn, Plymouth và thấp hơn so với gà AA.
Hoạt lực tinh trùng gà Đông Tảo đạt tiêu chuẩn. Tuy nhiên hoạt lực tinh trùng cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như phương pháp lấy tinh, tần suất khai
thác tinh, chế độ chăm sóc, ảnh hưởng của mùa vụ... Vì vậy, để tinh trùng gà Đông Tảo có hoạt lực tốt, cần có chế độ chăm sóc và nuôi dưỡng tốt, tần suất khai thác phù hợp và người khai thác tinh dịch phải có kỹ thuật thành thục.
Nồng độ tinh trùng là một trong những chỉ tiêu quan trọng. Chỉ tiêu này tương đối ổn định ở các giống, tuy nhiên nó cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố khách quan như thức ăn, giống, sức khỏe, ở những giống khác nhau, nồng độ tinh trùng khác nhau rõ rệt.
Nồng độ trung bình của tinh trùng gà Đông Tảo là 3,18 tỷ/ml tinh dịch. Kết quả của chúng tôi cũng tương đồng với một số tác giả khác. Theo tác giả Dương Đình Long, nồng độ tinh dịch ở một số giống gà: gà Rhode: 4,57 tỷ, gà Sussex: 3,85 tỷ, gà Hồ: 0,94 tỷ, gà Đông Tảo:3,40 tỷ, gà Ri: 4,24 tỷ. Tác giả Bahr and Bakst cho biết nồng độ tinh trùng trung bình là 5,0 tỷ.
Nồng độ tinh trùng có ý nghĩa quan trọng trong đánh giá chất lượng tinh dịch. Thường những mẫu có nồng độ tinh trùng cao, thì chất lượng tinh trùng tốt và hoạt lực tinh trùng cao. Nồng độ tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tuổi thành thục, chế độ khai thác, sử dụng, tình trạng bệnh lý, chăm sóc nuôi dưỡng… Ở gà thành thục về tính dục có nồng độ tinh trùng cao hơn so với những con chưa thành thục về tính dục, những con bị bệnh.
Tỷ lệ tinh trùng sống trung bình của gà Đông Tảo là 82,33%. Tỷ lệ tinh trùng sống phụ thuộc vào cá thể, tần suất khai thác tinh và kỹ thuật xử lý tinh dịch khi pha loãng bảo tồn. Tỷ lệ tinh trùng sống phản ánh phẩm chất tinh dịch và là cơ sở tính số lượng tinh trùng cần thiết cho liều phối.
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trung bình của gà Đông Tảo là 12,28%. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của tác giả Trịnh Văn Thân (1996) cho rằng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở một số giống gà như Rhoderi: 12,12 %, gà HBX: 13,25%, gà Hybro: 10,84%, gà Leghorn: 12,67%, gà AA: 13,06%, gà Plymouth: 11,23%.
Tỷ lệ kỳ hình tăng phụ thuộc vào khoảng cách lấy tinh. Khi khoảng cách lấy tinh ngắn thì tỷ lệ kỳ hình cao, khoảng cách lấy tinh dài cũng làm tăng tỷ lệ kỳ hình. Tinh dịch có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao thì ảnh hưởng xấu đến khả năng thụ thai và thế hệ đời sau.
Nghiên cứu phẩm chất tinh dịch gà thông qua các chỉ tiêu sinh học, nhằm đánh giá chất lượng đàn gà giống Đông Tảo. Mặt khác thông qua những chỉ tiêu
tinh dịch để chọn gà trống tốt hơn, giúp cho kỹ thuật thụ tinh nhân tạo tiến hành thuận lợi. Các chỉ tiêu chất lượng tinh dịch biến động rất lớn dưới tác động của các yếu tố như thức ăn, giống, tuổi, sức khỏe, điều kiện chăn nuôi…
4.2. MỘT SỐ CHỈ TIÊU LÝ - HÓA HỌC CỦA TINH DỊCH GÀ
Nghiên cứu được tiến hành trên 15 mẫu tinh dịch thu được từ các gà trống tham gia đề tài. Kết quả được trình bày tại bảng 2.
Bảng 4.2. Một số chỉ tiêu tính chất lý - hóa học của tinh dịch gà Đông Tảo
Số mẫu tinh dịch Áp lực thẩm thấu (miliosmol/kg) Năng lực đệm đối với acid
HCl 0,1N Tỷ trọng (so với nước cất) Độ nhớt pH 15 334,29 10,54 1011,14 12,08 1,01 0,02 2,07 0,35 7,3 0,1
Tính chất lý, hóa học của tinh dịch gà Đông Tảo được đánh giá ở 1 số chỉ tiêu, cụ thể: Áp lực thẩm thấu: 334,29miliosmol/kg, năng lực đệm: 1011,14 tỷ trọng so với nước cất: 1,01; độ nhớt: 2,07, pH: 7,3.
Áp lực thẩm thấu và pH của tinh dịch gà Đông Tảo tương đương với nghiên cứu của Sureerat (2015) cho rằng áp lực thẩm thấu của tinh dịch gà nuôi tại Thái Lan là 340,00 miliosmol/kg, pH tinh dịch là 7,31.
Tác giả Trịnh Văn Thân (1996) khi nghiên cứu tinh dịch một số giống gà cho kết quả pH tinh dịch: gà Rhoderi: 7,30, gà HBX: 7,16, gà Hybro: 7,20, gà Leghorn: 7,20, gà AA: 7,0, gà Plymouth: 7,5. Như vậy, pH tinh dịch gà Đông Tảo không chênh lệch nhiều với pH tinh dịch của một số giống gà khác.
Các kết quả nghiên cứu khoa học về một số tính chất lý, hóa học của tinh dịch gà Đông Tảo là cơ sở khoa học có ý nghĩa, trên cơ sở các số liệu thu được giúp chúng tôi lựa chọn được môi trường thích hợp để pha loãng tinh dịch, nhằm duy trì khả năng sống của tinh trùng gà Đông Tảo khi ở ngoài cơ thể.
4.3. KỸ THUẬT PHA LOÃNG TINH DỊCH GÀ
4.3.1. Một số chỉ tiêu lý - hóa học của một số môi trường pha loãng tinh dịch gà dịch gà
Nghiên cứu đã xác định một số tính chất lý - hóa học của hai môi trường pha loãng tinh dịch gà. Kết quả thu được cho thấy: tỷ trọng, độ nhớt và năng lực
đệm của hai môi trường pha loãng đều tương đương với tinh dịch gà Đông Tảo. Chỉ tiêu áp lực thẩm thấu, môi trường 1 có áp lực thẩm thấu là 330,48miliosmol/kg tương đương với áp lực thẩm thấu ở tinh dịch gà Đông Tảo là 334,29miliosmol/kg và thấp hơn so với áp lực thẩm thấu ở môi trường 2 là 380,35miliosmol/kg.
Bảng 3. Một số tính chất lý - hóa học của môi trường pha loãng tinh dịch gà
STT Áp lực thẩm thấu (miliosmol/kg) Năng lực đệm đối