Phần 3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch gà
3.3.1.1. Thể tích tinh dịch (V: ml)
Theo phương pháp của Milovanov, 1926; Chemineau, 1991: xác định qua pipet thủy tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia sẵn, đặt lọ thủy tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của mặt tinh dịch.
3.3.1.2. Hoạt lực tinh trùng (A: %)
Theo phương pháp của Milovanov, 1926; Chemineau, 1991: sức hoạt động được tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát được.
Đánh giá theo thang điểm 1 như sau:
Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 % tinh trùng tiến thẳng 100- 95 95- 85 85- 75 75- 65 65- 55 55- 45 45- 35 35- 25 25- 15 15- 5 Các bước tiến hành:
Dùng đũa thủy tinh sạch lấy một giọt tinh dịch sạch, ấm (30 - 35oC). Dùng một lá kính khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được dàn đều và không lẫn bọt khí. Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 400 lần. Trong khi kiểm tra tiêu bản được sưởi ấm ở 37 - 38oC.
Tinh trùng có 3 hình thức vận động: tiến thẳng, xoay vòng và lắc lư.
3.3.1.3. Nồng độ tinh trùng (C: tỷ/ml)
Theo phương pháp của Milovanov, 1926; Chemineau, 1991: dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha loãng hồng cầu, pha
loãng tinh dịch 200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101).
Trộn đều tinh dịch được pha loãng, bỏ 3 - 4 giọt đầu, nhỏ một giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị. Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và 1 ô ở giữa, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ có diện tích 1/400 mm2 và độ sâu 1/10 mm).
Nguyên tắc đếm:
Đếm tinh trùng theo đầu: đếm tinh trùng theo hàng, đếm hết hàng nọ sang hàng kia theo hình chữ chi. Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm 2 cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải). Đếm cả 2 buồng, đếm xong lấy kết quả trung bình, nếu kết quả 2 bên chênh nhau 30% thì phải làm lại hoặc nếu tinh trùng tụ thành đám thì cũng phải làm lại.
Công thức tính:
=n. D. 4000
N 100
Trong đó: C - Nồng độ tinh trùng trong tinh dịch n - Số tinh trùng đếm được
D - Mức độ pha loãng N - Số ô con đã đếm
Công thức đơn giản (nếu độ pha loãng 200 lần): C = n*107
3.3.1.4. Tỷ lệ tinh trùng sống (LS: tỷ/ml)
Theo phương pháp của Chemineau (1991):
Dung dịch nhuộm: Eosin 1g; Nigrosin 2g; Natri - citrate 5,5g; H2O 3,57g; nước cất hai lần 100ml, pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp lực thẩm thấu 310miliosmol/kg.
Tiến hành:
- Dùng phiến kính sạch và để ấm ở nhiệt độ 30oC
- Nhỏ 3 giọt dung dịch nhuộm (tương đương 30μl) lên một đầu kia của phiến kính.
- Thêm một giọt tinh dịch và trộn đều với dung dịch nhuộm trong vòng 10 giây.
- Sau khi pha trộn để 50 giây.
- Dùng phiến kính thứ hai nhẹ nhàng san đều hỗn hợp đã nhuộm.
- Đếm tổng số không dưới 150 tinh trùng, đều ở các vùng, tinh trùng sống không bắt màu.
- Tính tỷ lệ %
% = Số tinh trùng sống
Tổng số tinh trùng đếm 100
3.3.1.5. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K: %)
Theo phương pháp của William (1921) kết hợp với phương pháp Cheminau (1991).
- Làm tiêu bản: Phết lên kính một lớp mỏng, dàn đều tinh dịch lên phiến kính, hong khô tiêu bản trong không khí. Nhuộm màu tinh trùng, nhuộm đơn trong vòng 5 - 10 phút với thuốc nhuộm (Xanh Metylen, đỏ Fucxin, hỗn hợp Eosin và Nigrosin). Rửa tiêu bản bằng sức loang của giọt nước cất, hong khô.
- Quan sát bằng kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 400 - 1000 lần. - Đếm: lấy ngẫu nhiên, đếm lần lượt 300 - 500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình. - Tính K % = n Nx 100 Trong đó: K (%): Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình n: Số tinh trùng kỳ hình
N: Tổng số tinh trùng kỳ hình và bình thường đếm được (N = 300 - 500)