Nghiên cứu này đã tìm được điều kiện phù hợp nhất của phản ứng PCR trong việc phát hiện CIAV bằng cách tối ưu nhiệt độ bắt mồi (hình 4.1) và nồng độ mồi phù hợp (hình 4.2).
Hình 4.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,6oC. M: 100 bp DNA ladder. Ký hiệu vạch số 1 là các sản phẩm PCR đặc hiệu; vạch số 2 là sản phẩm PCR không đặc hiệu.
Ở dải nhiệt độ từ 45,0oC đến 55,8oC luôn quan sát được hai vạch sản phẩm PCR (ký hiệu số 1 và số 2, hình 4.1). Trong đó vạch số 1 có kích thước khoảng 1038bp là vạch đặc hiệu, vạch số 2 có kích thước khoảng 300bp là vạch không đặc hiệu (có kích thước không đúng với thiết kế). Ở dải nhiệt độ bắt mồi từ 58,5oC đến 65,6oC chỉ quan sát được vạch sản phẩm PCR số 1 (đặc hiệu, kích thước ~1038bp).
Về đậm độ của sản phẩm PCR đặc hiệu (vạch số 1), dễ dàng nhận thấy sự tăng dần về độ dày của vạch sản phẩm PCR từ khoảng 45,0oC đến 58,5oC. Nói cách khác, ở nhiệt độ bắt mồi thấp, lượng sản phẩm PCR ít hơn ở nhiệt độ bắt mồi cao.
Với hai nhận xét kể trên, chúng tôi chọn nhiệt độ bắt mồi phù hợp là 58,5oC để thực hiện phản ứng PCR. Qua đó cũng thấy rằng việc tối ưu nhiệt độ bắt mồi là vô cùng cần thiết để cho sản phẩm PCR đặc hiêu, với hiệu suất cao nhất.
Phản ứng PCR tiếp tục được tối ưu bằng việc điều chỉnh nồng độ mồi xuôi và nồng độ mồi ngược (hình 4.2).
Hình 4.2. Tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR
Nồng độ mồi và sự kết hợp nồng độ mồi xuôi và mồi ngược được trình bày ở bảng đi kèm. M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch của thang là 100bp.
Dễ dàng nhận thấy chỉ có giếng số 1 và giếng số 2 (tương ứng với công thức 0,5 µM mồi xuôi/ 0,5 µM mồi ngược và 0,25 µM mồi xuôi/ 0,5 µM mồi ngược) cho vạch sản phẩm. Các công thức kết hợp mồi khác đều không cho vạch sản phẩm PCR.
Qua kết quả trình bày ở hình 4.1 và 4.2, chúng tôi rút ra điều kiện tối ưu của phản ứng PCR phát hiện CIAV bằng cặp mồi CAVVP3F/ CAV2 là: (i) nhiệt độ bắt mồi 58,5oC; (ii)nồng độ mồi cuối cùng là 0,5 µM cho mỗi loại.