Tinh sạch ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau: (1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K,
- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1). - Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải. - Vortex hỗn hợp.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC. (3) Tủa and.
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều.
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút.
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC. (4) Rửa tủa and.
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC). - Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. (5) Hòa tan tủa and.
- Tủa ADN được hòa tan trong 30µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.5.3.Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR chẩn đoán CIAV
Cặp mồi đặc hiệu dùng phát hiện CIAV được lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (van Santen et al., 2001), trình tự được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1. Do thành phần của phản ứng PCR dùng trong nghiên cứu này và nghiên cứu trước đây có sự thay đổi, nên việc tối ưu lại phản ứng PCR là cần thiết.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen VP1
Tên mồi xuôi/ ngược
Trình tự 5’ – 3’ Kích thước
(bp)
CAVVP3F/ TTAAGATGGACGCTCTCCAAGAAGATACT 1038
/CAV2 GGCTGAAGGATCCCTCATTC
Hình 3.1. Sơ đồ các vùng gen của CIAV được nhân lên bởi mồi CAVVP3F/CAV2
Cặp mồi CAVVP3F/CAV2 sẽ nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP3 và một phần của gen mã hóa protein VP1 và VP2 của CIAV.
3.5.3.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,5oC sử dụng máy gradient PCR. Các điều kiện khác của phản ứng PCR như: nồng độ mồi, nồng độ sợi khuôn được đảm bảo đồng đều giữa các phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian
(giây) Số vòng lặp Tiền biến tính 94 180 1 Biến tính 94 15 40 Bắt mồi Gradient* 20 Kéo dài 72 90
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Ghi chú: Gradient bao gồm 12 nhiệt độ (oC) gắn mồi khác nhau: 45,0; 45,3; 46,4; 48,2; 50, 4; 53,0; 55,8; 58,5; 61,0; 63,1; 64,7; 65,5.
Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution 1x. Nhiệt độ gắn mồi ở đó không có vạch sản phẩm không đặc hiệu và vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất được lựa chọn là nhiệt độ bắt mồi tối ưu.
3.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ mồi
Nồng độ cuối cùng (final concentration) của mồi trong phản ứng PCR thường biến thiên trong khoảng 0,05-1 µM. Trong nghiên cứu này, nồng độ mồi cuối cùng được thiết lập biến thiên trong khoảng 0,5 µM đến 0,125 µM. Sự phối trộn giữa mồi xuôi- mồi ngược của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi
Mồi xuôi (nồng độ cuối cùng, µM) Mồi ngược (nồng độ cuối cùng, µM) 0,500 0,250 0,125 0,500 0,250 0,125
Mỗi nồng độ mồi xuôi sẽ lần lượt được kết hợp với 3 nồng độ của mồi ngược, theo sơ đồ trình bày ở bảng 3.3. Phản ứng PCR được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu (xác định ở mục tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, đồng thời đảm bảo thêm điều kiện đồng đều về thể tích phản ứng, nồng độ sợi khuôn.Sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafeNucleic Acid
Staining Solution 1x. Nồng độ mồi ở đó cho vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất sẽ được lựa chọn để thực hiện các phản ứng PCR xác định CIAV.