3.5.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên từ đàn gà bệnh: bệnh phẩm của gà có thể biểu hiện triệu chứng lâm sàng như ủ rũ, mệt mỏi, giảm ăn, kém ăn, kém vận động, khó thở, ỉa chảy. Tiến hành mổ khám lấy bệnh phẩm gồm gan, lách, ruột, tuyến ức, tuyến harder, túi fabricius, tủy xương. Đồng nhất mẫu, chuẩn bị huyễn dịch mẫu bệnh phẩm 10% và bảo quản ở -200C cho đến khi xét nghiệm.
3.5.2. Phương pháp tách chiết ADN
Tinh sạch ADN tổng số được thực hiện theo các bước như sau: (1) Ly giải mẫu
- 250 µl huyễn dịch mẫu bệnh phẩm được trộn đều trong 500 µl dung dịch sucrose/proteinase K,
- Ủ ở 56oC/90 phút hoặc 37oC/12giờ,
(2) Tách pha ADN bằng phenol-chloroform-isoamyl (25:24:1). - Bổ sung 200 µl dung dịch PCI vào ống mẫu sau khi ly giải. - Vortex hỗn hợp.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC. (3) Tủa and.
- Dùng ống Eppendorf mới, trộn 450μl isopropyl + 450μl dịch nổi phía trên, trộn đều.
- Tủa ADN ở -20oC/15 phút.
- Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC. (4) Rửa tủa and.
- Rửa mẫu bằng 1ml cồn 70% (pha trong nước cất đã xử lý DEPC). - Ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, ở nhiệt độ 4oC.
- Loại bỏ hết cồn. Hong khô ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. (5) Hòa tan tủa and.
- Tủa ADN được hòa tan trong 30µl dung dịch đệm TE (pH = 8,0).
3.5.3.Phương pháp tối ưu hóa phản ứng PCR chẩn đoán CIAV
Cặp mồi đặc hiệu dùng phát hiện CIAV được lựa chọn dựa theo nghiên cứu đã công bố (van Santen et al., 2001), trình tự được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1. Do thành phần của phản ứng PCR dùng trong nghiên cứu này và nghiên cứu trước đây có sự thay đổi, nên việc tối ưu lại phản ứng PCR là cần thiết.
Bảng 3.1. Trình tự mồi đặc hiệu phát hiện và giải trình tự gen VP1
Tên mồi xuôi/ ngược
Trình tự 5’ – 3’ Kích thước
(bp)
CAVVP3F/ TTAAGATGGACGCTCTCCAAGAAGATACT 1038
/CAV2 GGCTGAAGGATCCCTCATTC
Hình 3.1. Sơ đồ các vùng gen của CIAV được nhân lên bởi mồi CAVVP3F/CAV2
Cặp mồi CAVVP3F/CAV2 sẽ nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP3 và một phần của gen mã hóa protein VP1 và VP2 của CIAV.
3.5.3.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,5oC sử dụng máy gradient PCR. Các điều kiện khác của phản ứng PCR như: nồng độ mồi, nồng độ sợi khuôn được đảm bảo đồng đều giữa các phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian
(giây) Số vòng lặp Tiền biến tính 94 180 1 Biến tính 94 15 40 Bắt mồi Gradient* 20 Kéo dài 72 90
Kéo dài cuối cùng 72 300 1
Ghi chú: Gradient bao gồm 12 nhiệt độ (oC) gắn mồi khác nhau: 45,0; 45,3; 46,4; 48,2; 50, 4; 53,0; 55,8; 58,5; 61,0; 63,1; 64,7; 65,5.
Phân tích sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution 1x. Nhiệt độ gắn mồi ở đó không có vạch sản phẩm không đặc hiệu và vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất được lựa chọn là nhiệt độ bắt mồi tối ưu.
3.5.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng củanồng độ mồi
Nồng độ cuối cùng (final concentration) của mồi trong phản ứng PCR thường biến thiên trong khoảng 0,05-1 µM. Trong nghiên cứu này, nồng độ mồi cuối cùng được thiết lập biến thiên trong khoảng 0,5 µM đến 0,125 µM. Sự phối trộn giữa mồi xuôi- mồi ngược của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ mồi
Mồi xuôi (nồng độ cuối cùng, µM) Mồi ngược (nồng độ cuối cùng, µM) 0,500 0,250 0,125 0,500 0,250 0,125
Mỗi nồng độ mồi xuôi sẽ lần lượt được kết hợp với 3 nồng độ của mồi ngược, theo sơ đồ trình bày ở bảng 3.3. Phản ứng PCR được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu (xác định ở mục tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi, đồng thời đảm bảo thêm điều kiện đồng đều về thể tích phản ứng, nồng độ sợi khuôn.Sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 2%, có bổ sung RedSafeNucleic Acid
Staining Solution 1x. Nồng độ mồi ở đó cho vạch sản phẩm đặc hiệu sáng rõ nhất sẽ được lựa chọn để thực hiện các phản ứng PCR xác định CIAV.
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử
Mối quan hệ di truyền của CIAV (phylogenetic tree) được xây dựng dựa trên một phần trình tự gen mã hóa protein VP1 (từ codon số 1 đến codon số 203, bao gồm trình tự mã hóa vùng siêu biến đổi từ amino acid thứ 139 đến amino acid thứ 151). Phần mềm MEGA6 (Tamura et al., 2013) được dùng để xây dựng cây phát sinh chủng loại với các tham số đầu vào như sau: (i) phương pháp suy diễn cây phát sinh chủng loại là Neighbor-Joining; (ii) mô phỏng sự thay đổi nucleotide giữa các trình tự gen dựa vào mô hình Tajima-Nei và có hiệu chỉnh sự biến động giữa các nucleotide; (iii) mức tin cậy ở các nhánh của cây phát sinh chủng loại được ước tính bằng phép thử bootstrap lặp lại 1000 lần. Các trình tự tham chiếu (để xác định nhóm di truyền) dựa theo công bố trước đây (Olszewska-Tomczyk et al., 2016). Các trình tự gen dùng trong nghiên cứu này được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Trình tự gen tham chiếu
TT Mã số Tên chủng Nước Genotypea
1 AF227982 CAU269/7 Australia G1
2 EF683159 3711 Australia G1
3 JQ308213 CL37 Chile G2
4 DQ124936 AH4 Trung Quốc G2
5 AM407851 CH_SCK/04-05/GD/3450 Trung Quốc G2
6 AM407860 CH_CK/05-10/GD/17046 Trung Quốc G2
7 AM407864 CH_CK/04-01/GD/98 Trung Quốc G2
8 KJ004669 NI/77 Nhật Bản G2
9 AJ888519 CAV/Ibadan.NIE/11.02/100 Nigeria G2
10 KJ728827 18 Đài Loan G2
11 AF311900 98D06073 Mỹ G2
12 DQ124935 AH6 Trung Quốc G3a
13 AM407852 CH_CK/05-01/HN/592 Trung Quốc G3a
14 AM407827 CH_CK/05-05/GD/5258 Trung Quốc G3a
15 AF395114 BD-3 Germany G3a
16 EF159948 Haryana-Sonepet Ấn Độ G3a
17 AJ888528 CAV/Lanlate.NIE/11.02/71 Nigeria G3a
18 DQ016138 130 Slovenia G3a
19 DQ016139 469 Slovenia G3a
20 KJ728819 8 Đài Loan G3a
21 DQ141671 SH16 Trung Quốc G3b
22 KJ004672 EsCAV/F11 Nhật Bản G3b
23 AF313470 Del-Ros Mỹ G3b
24 AJ890284 Nobilis P4 vaccine G3b
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SỰ LƯU HÀNH CIAV Ở ĐÀN GÀ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN
4.1.1. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR để xác định CIAV
Nghiên cứu này đã tìm được điều kiện phù hợp nhất của phản ứng PCR trong việc phát hiện CIAV bằng cách tối ưu nhiệt độ bắt mồi (hình 4.1) và nồng độ mồi phù hợp (hình 4.2).
Hình 4.1. Tối ưu hóa nhiệt độ bắt mồi của phản ứng PCR
Nhiệt độ bắt mồi được thiết lập biến thiên từ 45,0oC đến 65,6oC. M: 100 bp DNA ladder. Ký hiệu vạch số 1 là các sản phẩm PCR đặc hiệu; vạch số 2 là sản phẩm PCR không đặc hiệu.
Ở dải nhiệt độ từ 45,0oC đến 55,8oC luôn quan sát được hai vạch sản phẩm PCR (ký hiệu số 1 và số 2, hình 4.1). Trong đó vạch số 1 có kích thước khoảng 1038bp là vạch đặc hiệu, vạch số 2 có kích thước khoảng 300bp là vạch không đặc hiệu (có kích thước không đúng với thiết kế). Ở dải nhiệt độ bắt mồi từ 58,5oC đến 65,6oC chỉ quan sát được vạch sản phẩm PCR số 1 (đặc hiệu, kích thước ~1038bp).
Về đậm độ của sản phẩm PCR đặc hiệu (vạch số 1), dễ dàng nhận thấy sự tăng dần về độ dày của vạch sản phẩm PCR từ khoảng 45,0oC đến 58,5oC. Nói cách khác, ở nhiệt độ bắt mồi thấp, lượng sản phẩm PCR ít hơn ở nhiệt độ bắt mồi cao.
Với hai nhận xét kể trên, chúng tôi chọn nhiệt độ bắt mồi phù hợp là 58,5oC để thực hiện phản ứng PCR. Qua đó cũng thấy rằng việc tối ưu nhiệt độ bắt mồi là vô cùng cần thiết để cho sản phẩm PCR đặc hiêu, với hiệu suất cao nhất.
Phản ứng PCR tiếp tục được tối ưu bằng việc điều chỉnh nồng độ mồi xuôi và nồng độ mồi ngược (hình 4.2).
Hình 4.2. Tối ưu nồng độ mồi của phản ứng PCR
Nồng độ mồi và sự kết hợp nồng độ mồi xuôi và mồi ngược được trình bày ở bảng đi kèm. M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch của thang là 100bp.
Dễ dàng nhận thấy chỉ có giếng số 1 và giếng số 2 (tương ứng với công thức 0,5 µM mồi xuôi/ 0,5 µM mồi ngược và 0,25 µM mồi xuôi/ 0,5 µM mồi ngược) cho vạch sản phẩm. Các công thức kết hợp mồi khác đều không cho vạch sản phẩm PCR.
Qua kết quả trình bày ở hình 4.1 và 4.2, chúng tôi rút ra điều kiện tối ưu của phản ứng PCR phát hiện CIAV bằng cặp mồi CAVVP3F/ CAV2 là: (i) nhiệt độ bắt mồi 58,5oC; (ii)nồng độ mồi cuối cùng là 0,5 µM cho mỗi loại.
4.2.2. Sự lưu hành CIAV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận
4.2.2.1. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu phục vụ nghiên cứu
Trên thế giới đã có nhiều công bố về sự lưu hành và gây bệnh của các chủng CIAV.Tại Việt Nam cho đến thời điểm này vẫn chưa có công bố nào về sự lưu hành của virus này. Do CIAV thường gây bệnh thể cận lâm sàng, nên có thể không biểu hiện triệu chứng điển hình. Cũng do đây là nghiên cứu đầu tiên để xác định sự có mặt của virus CIAV ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận,
chúng tôi đặt vấn đề lấy mẫu ở gà tất cả các lứa tuổi, các giống gà,khi có biểu hiện triệu chứng lâm sàng ủ rũ, mệt mỏi, v.v... Bảng 4.1 tổng hợp tình hình thu thập mẫu trong nghiên cứu này.
Bảng 4.1. Tổng hợp tình hình thu thập mẫu gà theo lứa tuổi
Lứa tuổi (tuần)
Tổng hợp
< 3 3 ÷ 5 ≥ 6
Số trại 1 6 7 14
Số mẫu 8 72 44 124
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài đã thu thập được mẫu từ 14 trại để kiểm tra sự lưu hành CIAV với tổng số mẫu thu được là 124. Mẫu được chia thành 3 nhóm lứa tuổi gồm gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi; gà từ 3 tuần đến 5 tuần tuổi và gà từ 6 tuần tuổi trở lên. Cơ sở của việc phân loại lứa tuổi trên là dựa vào đặc điểm dịch tễ của bệnh theo tài liệu tham khảo của các nghiên cứu trên thế giới (Eregae, 2014). Một số bệnh tích đặc trưng của gà khi mổ khám được thể hiện ở hình 4.3-4.6.
Hình 4.4. Gan sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết
Hình 4.6. Tuyến ức bị teo, xuất huyết 4.2.2. Kết quả PCR phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm
Thực hiện phản ứng PCR để xác định sự có mặt của CIAV trong các mẫu bệnh phẩm thu thập được chúng tôi có kết quả minh họa ở hình 4.7 và tổng hợp ở bảng 4.2.
Hình 4.7. Minh họa kết quả phản ứng PCR phát hiện CIAV
M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch là 100bp. Giếng 1-5 là 5 mẫu bệnh phẩm thu thập ở trang trại 1.
Ứng dụng điều kiện tối ưu của phản ứng PCR với mẫu thực địa, chúng tôi thấy ở những mẫu âm tính (số 2-5) không xuất hiện vạch sản phẩm. Mẫu số 1 có vạch sạch phẩm tương ứng với đối chứng dương, không thấy xuất hiện bất kỳ vạch không đặc hiệu nào. Như vậy điều kiện của phản ứng PCR và cặp mồi hiện thời hoạt động tốt. Tổng hợp kết quả chẩn đoán được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả PCR phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm
TT trại Số mẫu kiểm tra Số (+) Tỷ lệ % (+) Số (-) Tỷ lệ % (-) 1 14 5 35,71 9 64,29 2 9 6 66,67 3 33,33 3 8 8 100 0 0 4 10 10 100 0 0 5 7 6 85,71 1 14,29 6 6 6 100 0 0 7 16 3 18,75 13 81,25 8 8 0 0 8 100 9 8 3 37,50 5 62,50 10 10 3 30,00 7 70,00 11 7 5 71,43 2 28,57 12 6 3 50,00 3 50,00 13 8 2 25,00 6 75,00 14 7 3 42,86 4 57,14 Tổng hợp 124 63 50,81 61 49,19
Như vậy trong số 14 trại kiểm tra có đến 13 trại (tỷ lệ 92,86%) phát hiện có sự lưu hành của CIAV; chỉ duy nhất 01 trại (tỷ lệ 7,14%) âm tính với kết quả PCR phát hiện CIAV.
Trong tổng số 124 mẫu bệnh phẩm của gà có triệu chứng lâm sàng được kiểm tra thì tỷ lệ phát hiện được CIAV rất cao (63 mẫu dương tính, tỷ lệ 50,81%).
Kết quả trên cho thấy trong các đàn gà nuôi tại khu vực Hà Nội và vùng phụ cận có sự lưu hành phổ biến CIAV.Kết quả nghiên cứu này cho thấy sự cần thiết phải tiếp tục nghiên cứu về sự lưu hành của CIAV ở đàn gà nuôi tại các vùng khác nhau.Với đặc tính gây suy giảm miễn dịch thì sự lưu hành với tỷ lệ cao của CIAV trong đàn gà sẽ là một thách thức mới với người chăn nuôi tại Việt Nam.
Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của nhiều tác giả khác trên thế giới, khẳng định sự lưu hành của CIAV với tỷ lệ rất cao ở đàn gà.
Theo nghiên cứu của (Eregae, 2014) tại vùng Ontario, Canada, có 77,1% đàn gà broiler dương tính với CIAV, tỷ lệ mẫu kiểm tra dương tính với CIAV bằng phản ứng PCR là 55,4% (128 mẫu dương tính trong số 231 đàn kiểm tra). Tác giả cho rằng đây là kết quả không đáng ngạc nhiên do sự lưu hành rất rộng rãi của virus này trong tự nhiên.
Đồng thời khi so sánh với nhiều nghiên cứu trên thế giới về sự lưu hành của CIAV ở đàn gà kết quả cũng tương tự. Cụ thể: tại Bỉ, (Herdt et al., 2001) thu thập mẫu huyết thanh của 98 đàn gà broiler (6 tuần tuổi) được sinh ra từ 15 đàn gà bố mẹ giai đoạn từ 1993 đến 1997; khi kiểm tra bằng phản ứng ELISA đã phát hiện được cả 98 đàn dương tính với kháng thể kháng CIAV. Trong số các đàn kể trên, 86 đàn được theo dõi đến khi giết thịt thì tỷ lệ dương tính kháng thể kháng CIAV là 38,0% (33 đàn dương tính).
Tại Iran, Gholami-Ahangaran and Zia (2012) sử dụng phản ứng ELISA và PCR để xác định sự lưu hành kháng thể kháng CIAV ở đàn gà broiler mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm thể cận lâm sàng. Kết quả cho thấy 25 đàn gà 5-8 tuần tuổi thu thập từ các tỉnh Isfahan, Yazd, Tehran, Chaharmahalva-Bakhtiyari và vùng trung tâm Iran giai đoạn 2009-2010, mỗi đàn lấy 15 mẫu huyết thanh và 15 mẫu tuyến ức, đều dương tính với kháng thể kháng CIAV.
Một nghiên cứu khác được thực hiện tại Isfahan, một tỉnh trung tâm Iran để xác định sự lưu hành của CIAV ở đàn gà broiler khỏe mạnh. Từ năm 2009-2010 thu thập 240 mẫu tuyến ức của gà khi giết mổ, kiểm tra bằng phản ứng PCR cho thấy có 11 (73,3%) trong số 15 đàn dương tính với CIAV (Gholami-Ahangaran et al., 2011).
Trong khi đó, tại Shahrekord (miền trung Iran), một nghiên cứu được thực hiện để xác định sự lưu hành của CIAV, đồng thời kiểm tra chỉ tiêu huyết học và biến đổi bench lý ở những đàn gà nhiễm virus (Karimi et al., 2010). Lấy mẫu ngẫu nhiên từ 271 đàn gà 2-6 tuần tuổi.Ở các đàn gà này, kiểm tra đều dương tính với kháng thể kháng CIAV.
Tại miền Bắc Jordan, nghiên cứu thực hiện từ tháng 11/2005 đến 3/2006 để xác định lưu hành kháng thể kháng CIAV (Roussan, 2006). Tổng số 414 mẫu
kiểm tra được lấy từ 32 đàn gà 1-43 ngày tuổi.Kết quả ELISA cho thấy 100% các đàn đều dương tính với CIAV.
Tại Nigeria, khi tiến hành điều tra sự lưu hành của CIAV ở đàn gà (Owoade et al., 2004) với mẫu máu lấy từ 20 đàn gà thương phẩm ở bang Oyo và Lagos (miền Nam Nigeria), chia thành các nhóm: 10 đàn gà mái tơ, 7 đàn gà thịt, 1 đàn gà trống non, 1 đàn mái đẻ và 1 đàn gà giống. Sử dụng phản ứng ELISA để xác định sự có mặt của kháng thể trong mẫu huyết thanh gà. Kết quả cho thấy 11 đàn dương tính với kháng thể kháng CIAV (55%) với tỷ lệ lần lượt là 50%; 57,1%; 0; 100% và 100%.
So sánh tỷ lệ mẫu dương tính CIAV của lứa tuổi gà khác nhau được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Kết quả kiểm tra CIAV ở các lứa tuổi gà
Tuổi gà (tuần) Số trại