Quả cành hình thành chìm trong mô, hình cầu, hình gần cầu hoặc elip. Quả cành có kích thước 120 – 240 × 125 - 225 μm; vách quả cành bao gồm nhiều lớp, dày 25 - 70 μm, màu nâu nhạt đến nâu, là sự sắp xếp dày đặt của các tế bào rắn chắc có dạng hình cầu; bên trong vách bao gồm 1 - 2 lớp tế bào màu nâu nhạt, dần trở thành trong suốt về phía bên trong. Có một miệng nhỏ, ở giữa, rộng 7 - 8 μm, sâu 30 - 32 μm, mặt cắt có hình trụ, bao gồm các tế bào dày, có màu nâu sẫm. Bào tử đơn bào, trong suốt, không có vách ngăn, vách mỏng và mịn, hình elip đến dạng trứng ngược, thon dần về phía đuôi, kích thước 10 – 16 × 5 - 8 μm.
Bên ngoài bào tử được bao bọc bằng một lớp màng nhầy mỏng, dày 1 μm và màu trong trong suốt. Chất nhầy còn tạo thành phụ bộ có hình trụ, kích thước 7 – 14 × 1 - 2 μm, thẳng đến linh hoạt, không phân nhánh, nhọn về một hướng (Wang et al.,
2012; Wulandari et al., 2009).
Hình 2.2. Một số hình ảnh về nấm Phyllosticta citriasiana (Wang et al., 2009)
Đặc điểm tản nấm trên môi trường nuôi cấy: Trên môi trường MEA: Sợi nấm mọc sát môi trường, đều, kết thành một khối. Bề mặt màu xám chì ở trung tâm, rìa tản nấm có màu xám nâu hơi xanh và màu đen chì ở mặt dưới. Trên môi trường PDA, nấm mọc sát môi trường, lan rộng, rìa tản nấm với những sợi nấm mỏng, mịn. Bề mặt tản nấm màu xanh xám đen ở trung tâm, màu xám nhạt ở phần rìa và mặt dưới màu xanh đen và màu xanh lục vàng. Trên môi trường CMA, nấm mọc sát môi trường và không đều với rìa tản nấm dạng thùy. Bề mặt tản nấm màu xanh đen ở trung tâm, màu cám nhạt ở rìa và màu đen chì ở bên dưới tản nấm. Trên môi trường OA, nấm mọc sát môi trường và mọc không đều với rìa là những sợi nấm mảnh, mịn. Bề mặt tản nấm màu đen chì ở trung tâm, màu lục vàng ở rìa và màu đen chì đến màu xám ở mặt dưới tản nấm ((Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Ở nhiệt độ tối ưu: Sau hai tuần tốc độ tăng trưởng tối ưu đã được quan sát thấy ở nhiệt độ 30°C trên môi trường MEA, CMA và OA (22mm), trên môi trường PDA xảy ra ở nhiệt độ 27 °C (43 mm). Tốc độ tăng trưởng tối thiểu được quan sát thấy ở nhiệt độ 15 °C trên môi trường MEA (5mm), PDA (15mm), CMA (5mm) và OA (6mm). Tốc độ tăng trưởng cao nhất là ở nhiệt độ 33 °C trên môi trường MEA, CMA và OA (17mm), trên môi trường PDA xảy ra ở nhiệt độ 36 °C (3,5mm) (Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Theo Wulandari et al., (2009) thì loài P. citriasiana khác với hai loài gây hại trên cây có múi ở kích thước bào tử vô tính, đặc điểm môi trường và yêu cầu
nhiệt độ tối ưu để nấm phát triển. Loài P. citriasiana có kích thước bào tử lớn hơn so với loài Guignardia citricarpa và cho đến nay chỉ biết đến từ trạng thái của nó. Các vỏ bào tử vô tính là trung gian giữa loài G. citricarpa và loài G. mangiferae. Các vỏ này khá mỏng, giống loài G. citricarpa và dày hơn loài G. mangiferae. Trong môi trường tản nấm cũng sẫm màu hơn so với hai loài khác là màu xám chì đến đen trong tất cả các môi trường đã được kiểm tra. Nhiệt độ tối đa cho sự tăng trưởng xảy ra ở 30 – 33 °C, trong khi đối với loài G. citricarpa và loài G. mangiferae là ở 30 – 36 °C. Loài P. citriasiana có thể được phân biệt với loài G. citricarpa là loài P. citriasiana không sản xuất sắc tố màu vàng trên môi trường OA còn loài G. citricarpa sản xuất sắc tố màu vàng trên môi trường OA (Wang et al., 2012; Wulandari et al., 2009).
Sự phát sinh loài P. citriasiana có thể được phân biệt với hai loài G. citricarpa và loài G. mangiferae dựa trên ba vùng gien trình tự. Giữa loài P. citriasiana và loài G. citricarpa có 12 thay đổi nucleotide cố định và 1 indel đã được quan sát trên 602 nucleotide, trong khi TEF1 chứa 7 thay đổi nucleotide cố định và 2 indels hơn 271 nucleotide và ACT chỉ có 2 thay đổi nucleotide cố định trên 257 nucleotide (Wulandari et al., 2009).
Hình 2.3. Tản nấm P. citriasiana trên một số môi trƣờng (Wang et al., 2009) 2.6. NGUYÊN CỨU VỀ NẤM COLLTOTRICHUM SP. GÂY BỆNH THÁM THỨ TRÊN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÖI
2.6.1. Nghiên cƣ́ u về nấmColletotrichum gloeosporioides
Nấm Colletotrichum được nghiên cứu lần đầu tiên bởi Corda (1837), ban đầu được đặt tên là Collectothrichum, sau đó được ông đổi tên thành Collectrotrichum.
Các loài Colletotrichum gây ra bệnh tàn phá của quả cà phê ở châu Phi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến các loại ngũ cốc bao gồm ngô, mía và lúa miến. Chi
này gần đây đã được bầu chọn là nhóm nấm gây bệnh thực vật quan trọng thứ tám trên thế giới, dựa trên tầm quan trọng về khoa học và kinh tế.
Là mầm bệnh thực vật, các loài Colletotrichum được mô tả chủ yếu là gây bệnh thán thư, mặc dù các bệnh khác cũng được báo cáo như thối mía đỏ, bệnh berry cà phê, thối dâu và chuối, và bệnh đốm nâu đậu đũa (Lenné 2002). Các triệu chứng bệnh thán thư bao gồm hạn chế, thường bị tổn thương hoại tử trên lá, thân, hoa và quả, cũng như thối thân và thân cây, bệnh cháy lá cây ...
2.6.1.1. Phân loại nấm
Loài nấm C. gloeosporioides có phạm vi biến đổi rõ nhất trong các tiêu chuẩn dùng để phân loại sự khác nhau giữa các loài Colletotrichum. Loài nấm này có đặc điểm là bào tử không đồng nhất trên môi trường nuôi cấy, chính vì vậy mà việc phân loại cũng rất khó khăn vì không thể chỉ dựa vào đặc điểm hình thái.
Theo Sutton, 1992 giống Glomerella được phân thành 6 loài chuyên tính dựa trên các đặc tính sinh lý của từng loài bao gồm Glomeralla cingulata f. sp
Aschynomenes Daniel et al., 1973; Glomerella cingulata f. sp. Camelliae Dickens & Cook, 1989; Colletotrichum gloeosporioides f. sp. Cucurbitae Menten
et al., 1980; Colletotrichum gloeosporioides f. sp. Clidemiae Truilo et al., 1986;
Colletotrichum gloeosporioides f. sp. Manihotis Chevaug., 1956 và
Colletotrichum gloeosporioides var. minus Simmond., 1965.
Theo Mill P.R et al., 1992 các mẫu nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên các ký chủ như bơ, xoài, chuối, phong lan và cao su ở nhiều nước đã được tiến hành phân tích sinh học phân tử.
2.6.1.2. Phạm vi kí chủ
Việc xác định phạm vi ký chủ của Colletotrichum thường là rất khó. Các loài có mối quan hệ trong họ cà như ớt (Capsicum annuum: chili, peper), cà chua, khoai tây, cà tím…Tuy nhiên, không thể phân biệt được đặc điểm hình thái vì phạm vi kí chủ rất rộng, đặc biệt là vùng nhiệt đới.
Các giai đoạn bị ảnh hưởng: giai đoạn hoa, quả, sau thu hoạch, khi nảy mầm, gia đoạn cây con và các giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng. Ký chủ chính: ớt, ớt chuông (ớt tây), khoai lang Mỹ (củ từ), hồ tiêu, cà tím…
Theo số liệu của CABI thì nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại trên hầu hết các loại cây trồng ở 47 nước trên thế giới, đặc biệt phổ biến ở vùng nhiệt đới và vùng cận nhiệt đới. Ở vùng nhiệt đới giai đoạn tồn tại chủ yếu của nấm Colletotrichum gloeosporioides là sống hoại sinh trên mô chết hoặc những tàn dư của cây trồng. Do đó trong quá trình điều tra thường xuyên bắt gặp sự xuất hiện của nấm trên đồng ruộng.
Theo Kim et al. nấm Colletotrichum gloeosporioides được biết đến là nguyên nhân gây bệnh thán thư trên nhiều loại cây trồng. Isolated của nấm
Colletotrichum gloeosporioides từ các ký chủ khác nhau là không có tính đặc trưng rõ ràng theo từng cây ký chủ. Phạm vi ký chủ chính như: Đay, đậu Lupins, điều, đu đủ, bông, bơ, bưởi, cà chua, cà phê, cam, chanh, cao su, phong lan và các ký chủ phụ khác như các loại đậu, bí ngô, dưa, vải.
2.6.1.3. Sinh học và sinh thái bệnh
Nấm thường xuyên xâm nhiễm trên những phần đã chết hay những bộ phận bị tổn thương của cây trồng và thường có mặt trong các mẫu bệnh quan sát bên ngoài những mô khỏe. Trong điều kiện có ẩm độ và nhiệt độ cao nấm gây hại rất nghiêm trọng. Nấm Colletotrichum gloeosporioides được tìm thấy chiếm 41% trong vỏ hạt, 36% trong nội nhũ và 2% trong phôi hạt ớt cay. Qua quan sát mô tế bào ở cây non cho thấy nấm có khả năng truyền từ nội nhũ sang trụ mới dưới lá mầm rồi đến rễ mầm.
Phân loại các loài nấm Colletotrichum chủ yếu dựa vào đặc điểm tản nấm, hình dạng, kích thước bào tử, lông gai và giác bám. Tuy nhiên, theo Denis et al.,
1993 cho biết việc giám định loài nấm này cũng gặp nhiều khó khăn vì trên vết bệnh do nấm Colletotrichum gloeosporioides gây ra thường kèm theo các loại nấm hoại sinh và tác nhân xâm nhập thứ cấp. Nấm Colletotrichum gloeosporioides sinh trưởng phát triển và hình thành bào tử thuận lợi trên môi trường PDA và môi trường tổng hợp.
Nấm có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 4 ºC nhưng nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là từ 25 – 29 ºC và ẩm độ gần 100%, trong điều kiện này nấm gây hại nghiêm trọng nhất. Jeffries et al. (1990) cho rằng bệnh vẫn có thể xuất hiện trong điều kiện khô khi bào tử hoặc sợi nấm tiềm sinh xâm nhiễm vào mô bị tổn thương và mô già, điều này cho thấy bệnh vẫn có thể hình thành dịch trên quả. Sự nảy mầm của bào tử và xâm nhiễm của nấm
có liên quan chặt chẽ đến điều kiện môi trường. Điều kiện ẩm độ không khí cao tạo thuận lợi cho bào tử nảy mầm và xâm nhiễm vào cây ký chủ.
2.6.1.4. Hình thái học
Trên môi trường PDA, tản nấm có màu trắng xám nhạt đến màu xám đậm. Ở một số mẫu phân lập sợi nấm ký sinh chỉ hình thành những chòm liên quan đến sự hình thành quả thể và quả thể đôi khi hình thành trên tản nấm non phổ biến hơn so với tản nấm già. Đĩa cành hình thành trên các bộ phận của cây, có lông cứng dài, màu nâu, thuôn về phía đỉnh, hơi phồng nhẹ ở phần gốc. Bào tử phân sinh hình thành trên cành bào tử ngắn, hẹp, trong suốt, hình trụ, đầu hơi tù, đỉnh tròn, không có vách ngăn. Trên môi trường nhân tạo PDA, kích thước và hình dạng của bào tử có thể thay đổi so với trên cây ký chủ, khối bào tử hồng nhạt được hình thành trên cành bào tử phân sinh, bào tử nảy mầm và hình thành giác bám màu nâu, hình ô van hoặc hình quả đấm, kích thước 6 - 20 × 4 - 12 µm.
2.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC
Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum gây hại nặng trên hầu hết các vùng trồng ớt ở nước ta, là nguyên nhân thối quả hàng loạt trên cây ớt.
Ở nước ta đã có một số nghiên cứu về bệnh thán thư và được công bố. Theo Ngô Bích Hảo (1991) thì nguyên nhân gây bênh thối quả ớt là do 2 loài nấm Colletotrichum nigrum và Colletotrichum capsici. Bệnh thường xuất hiện và gây hại nặng vào giai đoạn đang thu hoạch quả, nhiệt độ trung bình là 28 – 30 ºC, độ ẩm 85 - 90%, mưa nhiều. Bệnh hại nặng vào tháng 4, 5, 6 (TLB 80% - Huế); tháng 6, 7, 8 (20% - Hà Nội). Vào thời điểm nhiệt dộ 20ºC bào tử nấm nảy mầm với tốc độ nhanh. Khả năng nhiễm bệnh của Isolate Colletotrichum nigrum trên giống ớt chìa vôi Huế là rất mạnh. Các isolate nấm Colletotrichum ở các vùng sinh thái khác nhau là khác nhau. Sự phân bố và mức độ gây hại của 2 loài nấm
C. nigrum và C. capsici có sự khác nhau. Ở vùng trồng ớt tỉnh Thừa Thiên Huế và thành phố Hà Nội, loài C. nigrum là phổ biến, và ngược lại ở Hải Dương, Hưng Yên, Hà Bắc thì loài Colletotrichum capsici phổ biến hơn. Tuy nhiên cả 2 loài này cùng phá hại mạnh vào cuối giai đoạn sinh trưởng của ớt tại khắp các vùng trồng. Ở giai đoạn quả già và chín, cây ớt đặc biệt mẫn cảm với bệnh. Quả càng già tỷ lệ nhiễm bệnh càng cao. Ở quả xanh tỷ lệ nhiễm bệnh là 8,64%, quả ương là 23,9%, quả chín là 44,47%. Ở nước ta, hai chủng C. nigrum và C. capsici thường song song phá hại làm quả ớt bị thối nhanh chóng.
Theo Ngô Bích Hảo năm 1991 bệnh thán thư hại ớt là một loại bệnh nguy hiểm và khó phòng trừ, do đó hướng chọn tạo giống ớt chịu bệnh là một yêu cầu cấp bách hiện nay. Theo đó, 73 giống được thu thập từ các giống gieo trồng trong sản xuất và cả những giống dại. Sau khi khảo sát tác giả đã chọn được giống Chìa vôi là giống đang được sử dụng rộng rãi ở các tỉnh miền trung cho năng suất cao, phẩm chất ngon; các giống Chỉ thiên Huế nhỏ của Việt Nam và Ấn Độ có khả năng chống chịu tốt các loại bệnh, trong đó có bệnh thán thư.
Biện pháp làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra như: luân canh cà chua với cây trồng không thuộc học cà. Làm giàn, tỉa bỏ cành, lá già phía gốc, nhổ sạch cỏ trong luống, tạo cho luống thông thoáng, thu gom loại bỏ tàn dư cây ra khỏi ruộng. Có thể sử dụng một số thuốc khi cây mới chớm xuất hiện: Topsin M 70WP (0.4 – 0.8 kg/ha), Benlate 50WP (1kg/ha).
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nấm chính hại trên cây quýt Khốp và cam Khe Mây tại Hà Tĩnh.
- Thời gian: Từ tháng 3 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019 - Địa điểm:
+ Vùng trồng quýt Khốp tại huyện Kỳ Anh và cam Khe Mây tại huyện Hương Đô.
+ Khu thí nghiệm nhà lưới Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới –Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
+ Tại Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh
- Điều tra thành phần bệnh hại quýt Khốp và cam Khe Mây tại Hà Tĩnh ở một số vườn trồng tập trung.
- Điều tra diễn biến một số bệnh nấm hại quýt Khốp và cam Khe Mây ở các vườn trồng.
- Xác định sự phát sinh phát triển của bệnh theo thời gian.
3.2.2. Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và phân loại
- Phân lập (5-10 mẫu) và đánh giá đặc điểm hình thái (tản nâm, bào tử) của nấm gây bệnh.
- Đo kích thước vết bệnh trên quả, lá của quýt Khốp và cam Khe Mây.
3.2.3. Nghiên cứu về sinh học nấm
- Nghiên cứu sự nảy mầm của bào tử nấm, phương thức xâm nhập và gây bệnh trên cây cam, quýt.
- Mức độ nhiễm bệnh trên cam, quýt.
- Mức độ nhiễm trên các bộ phận cây (lá, quả,...).
3.2.4. Nghiên cứu về phòng trừ
Ridomil Gold 68WG, Nano copper và Score 250EC).
- Đánh giá hiệu quả của một số loại thuốc hóa học trên IN VITRO (thuốc Ridomil Gold 68WG, Agri-Fos 400, Nano copper, Score 250EC, Nativo 750WG và thuốc Jack M9 72WP).
- Đánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học đến khả năng ức chế nảy mầm bào tử của nấm.
3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Giống cây ăn quả có múi: quýt Khốp và cam Khe Mây trên địa bàn các huyện Kỳ Anh và Hương Khê tỉnh Hà Tĩnh.
- Môi trường nuôi cấy: PDA, PCA, S10, T20.
- Các vật dụng và thiết bị cơ bản cần cho nghiên cứu nấm (hình thái và sinh học).
- Các vật dụng cần cho thí nghiệm đồng ruộng.
- Các hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm: Agar, đường Glucose, cồn 96 o, nước cất, nước cất vô trùng, thuốc trừ bệnh cây (thuốc Ridomil Gold 68WG, Agri-Fos 400, Nano copper, Score 250EC, Nativo 750WG và thuốc Jack M9 72WP, thuốc, Isacop 65,2WG, Topan 70WP, Nativo 750WG, Amistar top 325SC).
- Các giống cây dùng để đánh giá tính gây bệnh: cam CS1, bưởi thực sinh.
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra đồng ruộng
- Địa điểm điều tra: Điều tra tại những vùng trồng chính như: Kỳ Anh, Hương Khê.
- Phương pháp điều tra: Điều tra theo QCVN 01-38:2010/BNTPTNT, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng và