Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.3. Vật liệu nghiên cứu
- Giống cây ăn quả có múi: quýt Khốp và cam Khe Mây trên địa bàn các huyện Kỳ Anh và Hương Khê tỉnh Hà Tĩnh.
- Môi trường nuôi cấy: PDA, PCA, S10, T20.
- Các vật dụng và thiết bị cơ bản cần cho nghiên cứu nấm (hình thái và sinh học).
- Các vật dụng cần cho thí nghiệm đồng ruộng.
- Các hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm: Agar, đường Glucose, cồn 96 o, nước cất, nước cất vô trùng, thuốc trừ bệnh cây (thuốc Ridomil Gold 68WG, Agri-Fos 400, Nano copper, Score 250EC, Nativo 750WG và thuốc Jack M9 72WP, thuốc, Isacop 65,2WG, Topan 70WP, Nativo 750WG, Amistar top 325SC).
- Các giống cây dùng để đánh giá tính gây bệnh: cam CS1, bưởi thực sinh.
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra đồng ruộng
- Địa điểm điều tra: Điều tra tại những vùng trồng chính như: Kỳ Anh, Hương Khê.
- Phương pháp điều tra: Điều tra theo QCVN 01-38:2010/BNTPTNT, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng và QCVN 01-119-2012-BNNPTNT, quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại trên cây ăn quả có múi.
Điều tra định kỳ 7 ngày/ lần tại khu vực điều tra cố định. Tại khu vực điều tra, điều tra 10 điểm theo đường chéo, điểm điều tra cách mép vườn 1 hàng cây. Mỗi điểm điều tra 1 cây, mỗi cây điều tra 4 hướng, mỗi hướng chọn 1 cành nằm ở tầng giữa tán cây để điều tra. Đếm số quả bị bệnh trên tổng số quả của các cành để xác định tỷ lệ bệnh.
Lấy mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh, mỗi cây điều tra 4 hố nằm trong khu vực hình chiếu của tán cây, cách mép hình chiếu tán cây 30-50 cm. Mẫu được mang về phân tích tại phòng thí nghiệm Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thông tin của mẫu thu thập gồm: + Ngày, địa điểm thu mẫu, tên chủ hộ.
+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây) + Bộ phận cây bị hại.
+ Điều kiện đất đai (đất đồi, đất ruộng...), các biện pháp quản lý (phân bón, thuốc bảo vệ thực vật và vệ sinh đồng ruộng...)
Bảng mức độ bệnh đƣợc đánh giá theo thang 6 cấp
Cấp độ bệnh Số lƣợng quả trong vƣờn bị nhiễm bênh 0 Không bệnh + Bệnh ≤ 5 % ++ Bệnh từ > 5 – 25 % +++ Bệnh từ > 25 – 50 % ++++ Bệnh từ > 50 – 75 % +++++ Bệnh > 75 %
3.4.2. Phƣơng pháp thu thập mẫu
Thu mua mẫu bệnh tại các vườn cây cam, quýt ở các huyện Kỳ Anh, Hương Khê của tỉnh Hà Tĩnh. Các mẫu bưởi thu về được bọc nilon và lưu giữ ở nhiệt độ ở 25 o
C cho đến khi quan sát.
Các quả bưởi được thu là bưởi có những triệu chứng đốm quả thể hiện rõ trên bề mặt vỏ quả, số lượng đốm xuất hiện trên quả bưởi phải tương đối nhiều.
3.4.3. Phƣơng pháp điều chế môi trƣờng
- Môi trường PDA (Potato Glucose Agar) Thành phần:
+ Khoai tây: 200 gram + Agar: 20 gram
+ Glucose: 20 gram + Nước cất: 1000 ml
- Cách điều chế môi trường PDA: Khoai tây gọt sạch vỏ, cân đủ lượng cần dùng (200 gram), rửa sạch, thái nhỏ (1 x 1 cm) đun với lượng nươc cất đã tính (1000 ml) đun sôi trong thời gian 20 phút. Bỏ ra, gạn lọc lấy dịch trong, thêm cho đủ nước (1000 ml) rồi đun sôi trở lại, cho từ từ đường Glucose, Agar khấy đều và đun sôi cho đến khi tan Agar. Sau đó đổ môi trường đã nấu vào bình tam giác (đã rửa sạch và vô trùng). Đem bình tam giác chứa môi trường hấp khử trùng trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 °C (tương đương với áp suất 5 atm) trong vòng 30 phút.
- Môi trường PCA Thành phần: + Khoai tây 20 g + Cà rốt 20 g + Agar 20 g + Nước cất 1000 ml - Môi trường chọn lọc PSM
Thành phần như môi trường PCA nhưng cho thêm 3 loại kháng sinh: Kháng sinh:
+ Piramicin 10 ppm + Rifampicin 50 ppm + Hymexazol 50 ppm
Piramicin 0,4 ml hòa vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7 ml nước cất vô trùng (hộp nhựa này cần được bọc kín vì khi hóa chất này tiếp xúc với ánh sáng sẽ bị phân hủy và mất hiệu lực).
Rifampicin 0,05 g hòa vào hộp nhựa chứa 6,7 ml Methanol. Hymexazol 0,05 g hòa vào hộp nhựa chứa 6,7 ml nước cất vô trùng.
- Môi trường T20 Thành phần: + Nước cà chua
+ CaCO3 3g
+ Nước cất 1000ml
- Phương pháp chuẩn bị môi trường:
Chuẩn bị 2 – 3 quả cà chua xay bằng máy say sinh tố trong 2’, đổ ra cốc đong, lọc bằng vải mản lấy 200 ml phần dịch trong cà chua. Lấy dịch cà chua 20% nồng độ cuối rồi nước đun sôi tới 100°C. CaCO3 nghiền nhỏ cho vào nước cất vô trùng, dùng đũa thủy tinh khuấy cho tan, lọc qua vải màn lấy phần dịch nước vôi trong sau đó đổ vào dịch nước cà chua rồi kiểm tra nồng độ pH từ 6 -7.
Cho dịch nước cà chua và agar, thêm đủ lượng nước cần thiết vào bình tam giác, lắc đều rồi cho vào lò vi sóng cho tan agar, sau đó cho bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở áp suất 1,5 atm, nhiệt độ 121 °C trong 30 – 45 phút. Sau đó để nguội xuống 55 °C tiến hành đổ ra đĩa petri để nuôi cấy nấm.
- Môi trường S10 Thành phần: + Đậu tương 60g + Agar 20g
+ Nước cất 1000ml
- Phương pháp chuẩn bị môi trường:
Đậu tương khô ngâm qua đêm rồi rửa sạch với nước, đem đậu tương đã ngâm nghiền với 330 ml bằng máy say sinh tố, lọc bằng vải màn lấy phần dịch gốc đậu tương. Lấy dịch gốc đậu tương 10% nồng độ cuối. Cho dịch gốc đậu tương và agar, thêm đủ lượng nước cần thiết vào bình tam giác, lắc đều rồi cho vào lò vi sóng cho tan agar, sau đó cho bọc giấy bạc rồi đem hấp khử trùng ở áp suất 1,5 atm, nhiệt độ 121 °C trong 30 – 45 phút. Sau đó để nguội xuống 55 °C tiến hành đổ ra đĩa petri để nuôi cấy nấm.
3.4.4. Phƣơng pháp phân lập nấm
- Mẫu bệnh được thu về từ đồng ruộng về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình phân lập và cấy chuyển. Kỹ thuật phân lập nấm gây bệnh cần thiết phải tuân thủ một cách chính xác và có th ể sử dụng những kỹ thuật sau làm định hướng và thay đổi chúng tùy theo từng tác nhân gây bệnh và cây trồng cụ thể, bộ phận mô cây bị bệnh sao cho có kết quả tốt nhất.
+ Thay đổi thời gian khử trùng bề mặt mẫu bệnh. + Gọt bỏ lớp ngoài mẫu bệnh.
+ Điều chỉnh thành phần môi trường nuôi cấy chẳng hạn pH, dinh dưỡng.
Mẫu bệnh đươc thu từ đồng ruộng về phòng thí nghiệm để tiến hành quá trình phân lập và cấy chuyển, do bề mặt mô cây thường có nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh, chúng cần được tiêu diệt trước khi có thể phân lập tác nhân gây bệnh. Nhiều loại nấm và vi khuẩn hoại sinh mọc rất nhanh trên môi trường phân lập, vì thế rất khó để phân lập được tác nhân gây bệnh. Để quá trình phân l ập và cấy chuyển đạt hiệu quả ta tiến hành theo phương pháp phân lập sau:
Bước 1: Khử trùng bề mặt mô cây
Mẫu bệnh thu về rửa sạch bằng dung dịch nước máy và xà phòng Lifebuoy, có tác dụng khử trùng bề mặt, giảm bớt lượng nấm và vi khuẩn hoại sinh mọc trên bề mặt mô cây. Sau đó, rửa sạch lại bằng nước máy.
Nhúng mẫu vào dung dịch nước Javen khử trùng bề mặt trong khoảng 1/2- 3 phút tùy vật liệu cây.
Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng, để lên giấy thấm sạch và thấm khô.
Bước 2: Tiến hành cắt mô bệnh và cấy vào môi trường đặc hiệu
Lau sạch bàn làm việc bằng dung dịch cồn 90%, đốt đèn cồn để khử trùng môi trường xung quanh nơi chuẩn bị cấy.
Nhúng dụng cụ (kẹp, dao hoặc dao mổ) trong cồn 90% và hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn.
Mẫu lá, quả đã khử trùng có thể nhìn rõ vết bệnh tiến hành dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ (phần mang đi phân lập) chiều dài vết bệnh khoảng 1-3cm, chứa cả mô bệnh và mô khỏe (lưu ý chọn mô mới bị bệnh, không nên sử dụng các mô đã bị bệnh lâu bởi vì trên bề mặt các mô bệnh này thường có rất nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh), sau đó cấy lên môi trường nghèo dinh dưỡng WA, đặt những miếng cấy gần mép đĩa.
Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25°C, lý tưởng là trong điều kiện ánh sáng
Bước 3: Kiểm tra đĩa cấy hằng ngày, khi các sợi n ấm phát triển từ những
Bước 4: Giám định lần cuối dùng mẫu cấy đã được làm thuần từ một bào tử nảy mầm hoặc đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
Môi trường dùng để phân lập tùy thuộc vào tác nhân gây bệnh. Môi trường thạch nước cất WA nên sử du ̣ng thêm kháng sinh , là môi trường phân lập phổ biến nhất. Có thể sử dụng môi trường phân lập chọn lọc như peptone pentachloronitrobenzene agar (PPA) cho Fusarium.spp. Và môi trường chọn lọc
Phytophthora (PSM) cho Phytophthoraspp.
- Phương pháp phân lập nấm Phytopthora spp. theo phương pháp Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996)
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Nấm Phytophthora mọc trên môi trường giàu Carbonhydrate, amino acids và khoáng chất, thông thường là dạng gen thạch agar. Môi trường hay dùng là: cà rốt – agar, Khoai tây – dextrose agar, cà chua – agar, đậu tương – agar, PSM. Các chất kháng sinh như Piramicin 10 ppm, Rifampicin 50 ppm, Hymexazol 50 ppm có thể cho thêm vào để diệt các loại nấm phụ sinh khác ngoài Phytophthora.
- Phương pháp chẩn đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytopthora từ đất bằng bẫy cánh hoa hồng
Thu thập mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh.
Hòa đất vào nước cất vô trùng trong cốc với tỷ lệ 1 phần đất : 2 phần nước. Khuấy nhẹ đất trong cốc bằng đũa thuỷ tinh, để đất lắng xuống trong 2 giờ (tốt nhất để qua đêm).
Lấy cánh hoa hồng thả vào cốc nước trên. Để cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ 20-25°C.
Quan sát cánh hoa sau 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày. Khi thấy cánh hoa bị mất màu đem lên kinh hiển vi soi, quan sát thấy bào tử nấm Phytophthora.
Làm thuần cánh hoa đem cấy lên môi trường: PSM, PCA, PDA...
- Phương pháp phân lập nấm Phytopthora spp. trên môi trường chọn lọc PSM
Chọn mô bệnh có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mô bệnh sạch đất cát dưới vòi nước. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp.
Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 1%. Thời gian khử trùng từ 1/2 - 3 phút tuỳ vật liệu cây.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng.
Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ).
Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường PSM.
Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây…Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng thích hợp.
Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PCA, PDA, 20T, 10S. Toàn bộ việc phân lập được tiến hành trong điều kiện vô trùng và cách ly trong tủ cấy.
3.4.5. Phƣơng pháp cấy ria
Phương pháp cấy ria được dùng để làm thuần nấm trong môi trường: - Khêu ổ bào tử bằng que cấy nấm, không lấy quá nhiều bào tử.
- Di nhẹ que cấy theo các đường thẳng trên bề mặt môi trường PCA hoặc PDA
- Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25°C, lý tưởng là trong điều kiện ánh sáng - Ngày hôm sau quan sát , khi các sợi nấm phát triển từ đường cấy ria , cấy chuyển chúng sang môi trường PCA hoặc PDA (chú ý cắt ở đỉnh của sợi nấm với mô ̣t nửa chứa sợi nấm mô ̣t nửa chứa tha ̣ch).
- Giám định lần cuối dùng mẫu cấy đã được làm thuần từ một bào tử nảy mầm hoặc đỉnh sinh trưởng của sợi nấm.
3.4.6. Phƣơng phá p đo nồng đô ̣ bào tƣ̉ bằng buồng đếm hồng cầu
(Haemocytometer)
- Chuẩn bị di ̣ch bào tử
- Chuẩn bị buồng đếm hồng cầu + 1 lamen sa ̣ch - Trình tự :
+ Đặt lamen lên trên buồng đếm
+ Dùng pipet hút 9 µl dịch bào tử mép của 1 buồng đế m (có 2 buồng đếm/ 1 Haemocytometer)
+ Đếm số bào tử của mỗi diê ̣n tích A , B, C, D. - Tính toán :
+ Tính số bào tử trung bình của một diện tích = n + Nồng độ bào tử /ml = n x 104
3.4.7. Phƣơng pháp kích thích sinh bào tử
Cấy mẫu nấm Phyllosticta citriasiana trên môi trường PCA trong 5 - 7 ngày, dùng que cấy nấm đã được khử trùng chuyển những miếng thạch được đột bằng ống tròn (đường kính 4 mm) trong đĩa nấm và chuyển sang đĩa môi trường PCA mới, mỗi đĩa đặt 5 tới 6 miếng thạch, dải đều trên bề mặt đĩa.
Dùng các các lá thông được hấp khử trùng cắt ngắn thành những đoạn nhỏ dài từ 1 tới 1,5 cm đặt xung quanh vị trí có miếng thạch. Các đĩa được ử trong tủ ở 25 – 28°C để kích thích sinh bào tử.
Chỉ tiêu theo dõi: số bào tử/ quang trường
3.4.8. Phƣơng pháp lây nhiễm kèm các chỉ tiêu đánh giá
Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được thực hiện ở 2 phương pháp lây là có sát thương và không có sát thương. Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Chuẩn bị nguồn bệnh: Nguồn bệnh là bào tử phân sinh được lấy từ quả cành trên vết bệnh trên quả. Quả cành trên vết bệnh được lấy cho vào ống eppendorf chứa nước cất để giải phóng bào tử phân sinh. Nồng độ bào tử phân sinh được điều chỉnh đạt nồng độ 105 bào tử/mL.
3.4.8.1. Thí nghiệm lây nhiễm trên quả
Chọn 9 quả trưởng thành trong đó có 3 quả bưởi, 3 quả cam và 3 quả chanh kích thước tương đối đồng đều và quan trọng là không có xuất hiện những đốm bệnh trên vỏ quả. Các quả bưởi được rửa sạch bụi đất với nước sau đó thanh trùng bề mặt bằng cách ngâm trong cồn 70 ° khoảng 2 phút.
Tiến hành lây bệnh nhân tạo:
- Lây nhiễm trong phòng thí nghiệm: Lây nhiễm được tiến hành trên 3 loại quả có múi (quả bưởi, quả cam và chanh) với 3 lần nhắc lại. Trên mỗi một quả tiến hành lây theo 2 kiểu: Kiểu 1 dùng pipet nhỏ trực tiếp 20 μl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả (không tạo vết thương), kiểu 2 dùng que kim tạo 5 vết thương trên bề mặt quả sau đó nhỏ 20 μl dung dịch bào tử nấm lên bề mặt quả đã tạo vết thương. Sau đó đặt những quả bưởi bên trong hộp ẩm. Để quả ở nhiệt độ khoảng 25 – 28°C và ủ tối trong ba ngày đầu. Theo dõi sự biểu hiện triệu chứng trong vòng 15 ngày.
3.4.8.2. Lây nhiễm trên lá
Phương pháp lây nhiễm trên lá cũng được tiến hành giống như lây nhiễm trên quả. Thí nghiệm cũng được thực hiện trên 3 loại lá (lá bưởi, lá cam và lá chanh) với 3 lần nhắc lại.
3.4.8.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo trên cây bằng cách đặt các mảnh môi
trường nuôi cấy chứa nấm vào gốc cây
Cây cam, bưởi được trồng vào chậu.
Tưới dịch môi trường nấm vào gốc cây (5ml/cây) sau đó phủ đất quanh gốc, sau đó tưới nước giữ ẩm đất trong thời gian lây bệnh.
Thí nghiệm có 7 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần.
đã lây bệnh chuẩn đoán nhanh sự hiện diện của nấm Phytopthora, pythyum, Fusarium bằng cách bẫy hoa hồng.