3.4.1. Vacxin
-Vacxin được sử dụng là vacxin tai xanh vô hoạt nhũ kép được chế từ chủng PRRS HUA 01.
3.4.2. Động vật thí nghiệm:
- Thí nghiệm gồm 10 con lợn rừng 9 tuần tuổi có trọng lượng từ 6 – 7 kg không tiêm phòng vacxin PRRS, không nhiễm PRRS, không có chứa kháng thể kháng PRRSV.
3.4.3. Trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất
- Dụng cụ, hóa chất sử dụng trong phản ứng ELISA, máy đo chỉ tiêu huyết học CELL-DYN 3700.
- Chuồng trại, thức ăn, nước uống, chế độ chăm sóc và nuôi dưỡng để lợn phát triển bình thường.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để tiến hành nghiên cứu và thực hiện được các nội dung đã đề ra của đề tài, chúng tôi đã sử dụng kết hợp những phương pháp nghiên cứu thường quy và hiện đại trong lĩnh vực thú y:
3.5.1. Lựa chọn lợn thí nghiệm - Số lợn được nuôi: 10 con - Số lợn được nuôi: 10 con
- Độ tuổi của lợn lúc bắt về: 9 tuần tuổi
- Tình trạng sức khỏe: không nhiễm PRRS, không có chứa kháng thể kháng PRRSV. Bảng 3.1. Đặc tính của lợn thí nghiệm STT Đặc tính Lợn 1 Lợn 2 Lợn 3 Lợn 4 Lợn 5 Lợn 6 Lợn 7 Lợn 8 Lợn 9 Lợn 10 Cân nặng (kg) 6,5 6,8 6,2 6,1 6,8 6,5 6,4 6,9 6,7 6,7 Màu lông Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Đen sọc vàng Tính biệt Đực Cái Đực Đực Cái Đực Đực Cái Đực Cái Thể trạng Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường Bình thường 3.5.2. Bố trí thí nghiệm
Tiến hành nghiên cứu trên 10 lợn 9 tuần tuổi, có trọng lượng từ 6-7 kg, chia làm 2 lô gồm, mỗi lô 5 con: 1 lô đối chứng không tiêm vacxin và 1 lô thí nghiệm được tiêm 2ml vacxin vô hoạt nhũ kép chủng PRRS HUA 01, nuôi cách ly , với điều kiện nuôi dưỡng như nhau.
Thí nghiệm: Địa điểm thí nghiệm tại Khu thí nghiệm động vật khoa Thú y - Học viện Nông Nghiệp Việt Nam. Chuồng nuôi được vệ sinh sạch sẽ, phun thuốc sát trùng định kỳ để tránh lây nhiễm mầm bệnh.
Trước khi gây bệnh thực nghiệm, theo dõi nhiệt độ, tình trạng sức khỏe của lợn trước khi gây nhiễm 7 ngày. Tiến hành lấy máu, chắt huyết thanh kiểm tra kháng thể PRRS bằng phương pháp ELISA để khẳng định không nhiễm PRRS, không có chứa kháng thể kháng PRRSV.
tai. Sau khi tiêm vacxin, theo dõi lợn hàng ngày, đo thân nhiệt, tần số hô hấp, nhịp tim, triệu chứng lâm sàng. Vào ngày 3, ngày 7, ngày 14, ngày 21, ngày 28, ngày 35 sau khi tiêm vacxin sẽ lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phương pháp ELISA, đồng thời tiến hành lấy máu đếm số lượng bạch cầu, hồng cầu bằng máy đo chỉ tiêu huyết học CELL-DYN 3700.
3.5.3. Phương pháp tách lấy huyết thanh
Định kì lấy máu lợn hàng tuần để kiểm tra hàm lượng kháng thể có trong máu dùng kim tiêm lấy khoảng 2ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn thí nghiệm, để máu trong ống tiêm sạch nghiêng khoảng 30 độ để huyết khối hình thành dọc theo thành ống. Đậy nắp, để yên tĩnh ở nhiệt độ phòng 5 đến 6 giờ, rót lấy huyết thanh (khi cần ly tâm 5000 vòng/ phút trong vòng 10 phút trước khi hút huyết thanh). Pha azide natri 1: 20000 để chống nhiễm khuẩn, nút kín, đánh dấu và bảo quản ở -200C cho đến khi làm xét nghiệm.
3.5.4. Phương pháp ELISA
Các bước thực hiện phản ứng ELISA:
Bước 1: Chuẩn bị các dụng cụ của bộ test ELISA để ở nhiệt độ phòng. Lấy từ trong túi ra tấm dụng cụ có các giếng có tấm kháng nguyên.
Bước 2: Bổ sung 100µl mẫu pha loãng trong DWP (Deep-well-plate) vào trong các giếng.
Bước 3: Bổ sung thêm 100µl thuốc thử đối chứng dương và đối chứng âm vào các giếng xác định.
Bước 4: Ủ tấm kháng nguyên trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 220C-270C.
Bước 5: Rửa tấm phủ kháng nguyên sau khi ủ ở bước 4, 3 lần bằng máy rửa tự động ELISA với mỗi lần 300µl dung dịch đệm.
Bước 6: Quá trình rửa hoàn tất khi dùng khăn giấy lau nhẹ để loại bỏ hoàn toàn bộ đệm còn sót lại.
Bước 7: Thêm 100µl hRPO anti-swine igg vào từng giếng và ủ ấm trong vòng 30 phút.
Bước 8: Rửa tấm kháng nguyên ở bước 7 như rửa ở bước 5 và bước 6. Bước 9: Thêm 100µl TMB substrate. Ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng
nếu phản ứng dương tính tấm phủ kháng nguyên sẽ nổi rõ màu xanh lá cây. Bước 10: Thêm vào 50µl TMP để dừng phản ứng. Màu sắc sẽ thay đổi sang màu vàng.
Bước 11: Đọc kết quả: Độ hấp thụ quang (OD) bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm.
-Kết quả:
Kiểm tra hiệu lực:
* OD ≥ 0,5 dương tính (PC) * OD ≤ 0,3 âm tính (NC) Tính toán:
CPC = OD (dương tính (PC)) – OD (âm tính (NC)) SP = OD (của mẫu) – OD (âm tính (NC))
+ Nếu SP ≥ 0,4 dương tính (0,4 ≤ SP < 0,8 (+); 0,8 ≤ SP < 1,5 (++); 1,5 ≤ SP (+++))
+ Nếu 0,3 ≤ SP ≤ 0,4 nghi ngờ + Nếu SP ≤ 0,3 âm tính
3.5.5. Phương pháp quan sát, mô tả
Theo dõi hàng ngày: đo thân nhiệt, hô hấp quan sát và ghi chép các biểu hiện lâm sàng.
3.5.6. Phương pháp đo chỉ tiêu huyết học
Đếm số lượng bạch cầu, hồng cầu: máu bảo quản trong ống chống đông dùng để đo số lượng bạch cầu, hồng cầu bằng máy đo chỉ tiêu huyết học CELL- DYN 3700.
3.5.7. Phương pháp tiến hành phản ứng RT-PCR
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Thể tích cần lấy (µl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu RNA 5,0 Primer Forward 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nước cất 6,0
Tổng thể tích 25
Chúng tôi sử dụng cặp mồi một phần gen S với độ dài 651bp, có trình tự nucleotide 5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’ (PS1, forward) và 5’- CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3’ (PS2, backward) theo Park, 2007; Chen, 2008).
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.4. Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
1 Tổng hợp cDNA 55 30 phút 1 Duỗi mạch 94 5 phút 2 Duỗi mạch 94 15 giây 35 Gắn mồi 53 30 giây Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 3 Hoàn chỉnh 72 5 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4
3.5.8. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di agarose và polyacrylamid là TBE hoặc TAE, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng TBE và agarose để tạo bản gel.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TBE 1X hòa tan với 1,2 gram agarose đặt trong lò vi sóng ở 1000C trong vòng 5 phút, đổ vào khuôn các lược được cài sẵn để tạo bản gel với các giếng tra mẫu cần điện di. Khi bản gel đã đông cứng đặt bản gel vào bể điện di và bổ sung dung dịch đệm TBE ngập bản gel khoảng 3 – 5 mm.
Bước 2: Tra mẫu điện di
Thêm 2µl loading dye vào 8 µl sản phẩm RT- PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản thạch. Điện di đồng thời cả thang chuẩn DNA (marker), thường sử dụng 4-6µl DNA Marker.
Bước 3: Chạy điện di
Nguồn điện trong điện di thường sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.
Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả
Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5-7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.
3.5.9. Phương pháp thu thập số liệu, xử lý số liệu
Thống kê triệu chứng, nhiệt độ, số lượng bạch cầu, số lượng kháng thể… sau các thời gian gây nhiễm virus, xử lý số liệu và vẽ biểu đồ biểu diễn tiến triển của bệnh, nhiệt độ, số lượng bạch cầu, số lượng kháng thể …bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2010, Minitab 14.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT QUẢ THEO DÕI CÁC CHỈ TIÊU LÂM SÀNG CỦA LỢN
TRƯỚC VÀ SAU KHI TIÊM VACXIN PRRS VÔ HOẠT CHỦNG HUA 01 4.1.1 Kết quả xét nghiệm kháng thể PRRSV của lợn trước khi tiêm vacxin
PRRS vô hoạt nhũ kép chủng HUA 01
Trước khi tiêm vacxin vô hoạt PRRS, các lợn được theo dõi trong vòng 7 ngày thấy lợn khỏe mạnh, ăn uống bình thường, không sốt, không có hiện tượng ỉa chảy. Chúng tôi tiến hành lấy máu của 10 lợn thí nghiệm, chắt huyết thanh kiểm tra sự tồn tại kháng thể kháng PRRSV bằng phương pháp ELISA. Kết quả được trình bày trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng PRRSV bằng phương pháp ELISA STT Lợn S/P Kết quả 1 ĐC1 0,12 - 2 ĐC2 0,28 - 3 ĐC3 0,12 - 4 ĐC4 0,15 - 5 ĐC5 0,15 - 6 TN1 0,17 - 7 TN2 0,14 - 8 TN3 0,19 - 9 TN4 0,08 - 10 TN5 0,15 -
Chú thích: ( - ): Âm tính, ĐC: đối chứng, TN: thí nghiệm
Quan sát Bảng 4.1, kết quả xét nghiệm huyết thanh bằng phương pháp ELISA thấy, cả 10 lợn được lựa chọn cho thí nghiệm đều có chỉ số S/P < 0,4, lợn số 9 có tỷ lệ S/P = 0,08 là thấp nhất, âm tính, chứng tỏ lợn không tồn tại kháng thể chống lại bệnh PRRS. Lợn số 2 có tỷ số S/P cao nhất cũng chỉ đạt 0,28 âm tính. Cả 10 lợn đều không có kháng thể kháng PRRSV trong máu, tức là không có khả năng bảo hộ cho lợn khi bị PRRSV tấn công.
Đồng thời với việc kiểm tra sự tồn tại của kháng thể kháng PRRSV bằng phương pháp ELISA, chúng tôi tiến hành kiểm tra sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phương pháp RT – PCR.
Kết quả được trình bày trong Bảng 4.2:
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus PRRS và một số virus khác bằng phương pháp RT – PCR STT Lợn PRRS PCV2 LMLM DTL PED TGE 1 TN1 - - - - 2 TN2 - - - - 3 TN3 - - - - 4 TN4 - - - - 5 TN5 - - - - 6 ĐC1 - - - - 7 ĐC2 - - - - 8 ĐC3 - - - - 9 ĐC4 - - - - 10 ĐC5 - - - -
Ghi chú: + Dương tính; - Âm tính
PCV2 : hội chứng còi cọc sau cai sữa do virus Porcine circovirus type 2 (PCV2) gây ra.
LMLM: Bệnh lở mồm long móng DTL: Bệnh dịch tả lợn
PED: dịch tiêu chảy ở lợn con
TGE: Bệnh viêm dạ dày ruột truyền nhiễm
Theo Bảng 4.2 ta thấy, toàn bộ 10 con lợn đều cho kết quả âm tính với virus PRRS, PCV2, LMLM, DTL, PED, TGE.
4.1.2. Thân nhiệt của lợn trước và sau khi tiêm vacin PRRS vô hoạt
Trong quá trình bố trí thí nghiệm, hàng ngày chúng tôi tiến hành kiểm tra đo thân nhiệt của lợn trong 7 ngày trước khi tiêm vacxin và 21 ngày sau khi tiêm vacxin PRRS vô hoạt nhũ kép chủng HUA 01. Vì kiểm tra thân nhiệt là một trong những khâu quan trọng không thể thiếu được trong chẩn đoán lâm sàng. Căn cứ vào nhiệt độ của cơ thể có thể thấy phần nào mức độ ảnh hưởng của vacxin với cơ thể lợn và phản ứng đáp ứng của lợn với vacxin đó.
Sốt là trạng thái tăng thân nhiệt do trung tâm điều hòa nhiệt bị tác động bởi các nhân tố gọi là chất gây sốt, đưa đến kết quả tăng sản nhiệt kết hợp với giảm thải nhiệt.
Theo dõi thân nhiệt của lợn qua từng ngày sau khi tiêm vacxin vô hoạt, kết quả được thể hiện trong Bảng 4.3
Bảng 4.3. Thân nhiệt của lợn trước và sau khi tiêm vacxin.
Thời gian theo dõi (ngày) LôTN (n = 5) x m X Lô ĐC (n = 5) x m X Trước khi tiêm vacxin -1 38,17±0,09 38,53±0,15 -2 38,56±0,09 38,26±0,15 -3 38,30±0,06 38,14±0,05 -4 38,56±0,07 38,34±0,29 -5 38,33±0,12 38,65±0,05 -6 38,35±0,06 38,57±0,05 -7 38,31±0,15 38,74±0,05
Sau khi tiêm vacxin 1 39,60±0,09 38,42±0,13 2 40,20±0,19 38,35±0,05 3 39,07±0,11 38,45±0,10 4 39,20±0,27 38,60±0,10 5 39,12±0,41 38,06±0,06 6 38,90±0,44 38,35±0,08 7 38,77±0,33 38,53±0,10 8 38,50±0,24 38,62±0,10 9 38,14±0,13 38,25±0,05 10 38,28±0,32 38,37±0,15 11 38,18±0,34 38,45±0,05 12 38,42±0,52 38,31±0,21 13 38,15±0,26 38,32±0,15 14 38,33±0,13 38,35±0,10 15 38,23±0,34 38,35±0,25 16 38,31±0,14 38,31±0,32 17 38,33±0,34 38,27±0,10 18 38,33±0,12 38,35±0,32 19 38,23±0,12 38,32±0,00 20 38,12±0,07 38,35±0,05 21 38,26±0,33 38,20±0,30 .
Hình 4.1. Biến động nhiệt độ của lợn trước và sau khi tiêm vacxin PRRS vô hoạt nhũ kép chủng HUA 01 thử nghiệm
Nhận xét :
Căn cứ theo bảng 3.3 và hình 4.1 ta thấy: Từ Bảng 4.3 ta thấy, nhiệt độ trung bình của 10 lợn ở 7 ngày trước khi tiêm vacxin PRRS vô hoạt là bình thường khoảng 38,140C – 38,740C. Không có sự chênh lệch nhiều giữa con đối chứng với con thí nghiệm tiêm vacxin PRRS vô hoạt.
Sau khi tiêm vacxin, từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 4 thân nhiệt của lợn tiêm vacxin có sự thay đổi với thân nhiệt của lợn không được tiêm vacxin hay nói cách khác thân nhiệt của lợn lô thí nghiệm tăng lên so với lô đối chứng. Thân nhiêt lợn thí nghiệm tăng lên đến 40,2 oC, cao hơn lợn đối chứng từ 1,54- 2,26
oC. Thân nhiệt cao nhất ở lợn TN1 vào ngày thứ 2 tăng lên đến 40,2oC và lợn TN2, TN5 ở ngày thứ 3 tăng lên đến 40oC. Điều đó chứng tỏ vacxin khi đưa vào cơ thể lợn được coi là chất lạ và chất lạ đó đã tác động tới cơ thể con vật khiến con vật sốt nhẹ.
Từ ngày thứ 5 đến ngày 21 sau khi tiêm vacxin thân nhiệt lợn, bắt đầu có dấu hiệu giảm dần trở về nhiệt độ sinh lý bình thường của cơ thể. Sau khi tiêm vacxin vào cơ thể sẽ có quá trình đáp ứng miễn dịch, huy động các tế bào có thẩm quyền miễn dịch xử lý kháng nguyên, trong quá trình này sẽ sản xuất ra
IL1,6, đây là chất gây sốt, tác động lên trung khu điều nhiệt ở thần kinh trung ương làm tăng cường quá trình thải nhiệt nên làm cho con vật bị sốt, đồng thời, sốt tác động ngược trở lại làm tăng cường thải nhiệt nên làm tăng cường quá trình đáp ứng miễn dịch. Sau khi quá trình đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên hoàn thiện thì yếu tố IL1,6 không được sản xuất nữa, khi đó sẽ không còn tác nhân gây sốt, thân nhiệt của con vật sẽ trở về trạng thái bình thường. Điều đó chứng tỏ vacxin PRRS vô hoạt nhũ kép chủng HUA 01 khi đưa vào cơ thể lợn là chất lạ và chất lạ đó đã khích thích cơ thể lợn sản sinh kháng thể chống lại và làm tăng cường hoạt động của các cơ quan khiến con vật sốt nhẹ. Các ngày sau từ ngày thứ 8 trở đi các lợn thí nghiệm tiêm vacxin không sốt và ăn uống bình thường trở lại, chứng tỏ cơ thể lợn đã dần thích nghi với kích thích do đưa chất lạ vào trong cơ thể và các cơ quan hoạt động bình thường trở lại.
Diễn biến về thân nhiệt khi lợn mắc PRRS được Yonggang Liu và cs, 2010 cho biết: Có tới 13 trong số 16 lợn thí nghiệm sốt trên 400C ở các ngày thứ 5, 6 và 9, chủ yếu là 40,2 - 40,50C. Cá biệt có trường hợp sốt 410C ở 21 ngày, sau đó thân nhiệt giảm xuống còn 400C sau 3 - 6 ngày. Kết quả này tương tự như theo dõi của tôi, song biến đổi thân nhiệt ở lợn thí nghiệm của tôi thấp hơn tác giả trên.
4.1.3. Tần số hô hấp của lợn trước và sau khi tiêm Vacxin
Song song với việc đo nhiệt độ của lợn thí nghiệm, chúng tôi tiến hành theo dõi tần số hô hấp của lợn trong quá trình nuôi. Kết quả biến động tần số hô hấp