4. Cấu trúc của luận văn
2.1. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Muỗi Anopheles dirus và muỗi Anopheles epiroticus tại phòng thí
nghiệm khoa Côn Trùng Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
- Quần thể muỗi Anopheles tại thực địa.
2.1.2. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện từ tháng 04/2019 đến tháng 08/2020.
2.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm khoa Côn trùng Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn. - Xã Ia Mla’h, xã Chƣ Rcăm huyện Krông Pa tỉnh Gia Lai.
* Giới thiệu địa điểm nghiên cứu * Huyện Krông Pa tỉnh Gia Lai
Huyện Krông Pa nằm ở phía Đông Nam của tỉnh Gia Lai, giáp với huyện Ea H'leo và thị xã Ayun Pa ở phía Tây; Ia Pa ở phía Bắc; huyện Đồng Xuân, Phú Yên phía Đông bắc; huyện Sơn Hòa, Phú Yên phía Đông; huyện Sông Hinh, Phú Yên phía Đông Nam; huyện Ea Kar, Đăk Lăk phía nam; huyện Krông Năng, Đăk Lăk phía Tây Nam. Diện tích toàn huyện rộng 1.623,6 km² và có 78.074 nhân khẩu, huyện có 14 xã và thị trấn, 132 thôn, các dân tộc thiểu số chiếm khoảng 71%, trong đó chủ yếu là ngƣời dân tộc Gia Rai. Đây là huyện có tình hình SR diễn biến phức tạp nhất ở tỉnh Gia Lai cũng nhƣ ở khu vực MT-TN. Riêng trong năm 2015 số ca mắc SR tại huyện Krông Pa cao nhất với 1.129 ca chiếm 51,1% số ca mắc trên toàn tỉnh.
28
Hình 2.1. Bản đồ địa điểm nghiên cứu tại huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai
* Điểm nghiên cứu xã Chƣ Rcăm: Xã Chƣ Rcăm thuộc huyện miền núi Krông Pa, nằm ở tọa độ 13018’20’’ độ vĩ bắc và 1080
36’61’’ kinh đông
với độ cao khoảng 130 m so với mực nƣớc biển. Xã Chƣ Rcăm là xã miền núi nằm trong vùng sốt rét lƣu hành của huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai. Sinh cảnh xã Chƣ Rcăm chủ yếu là rừng cây công nghiệp nhƣ rừng cây tự nhiên, rừng cây cao su và rừng cây điều. Xen lẫn giữa các rẫy của dân địa phƣơng trong vùng trồng cây nông nghiệp nhƣ mì, bắp, lúa. Xã Chƣ Rcăm hiện có 8 thôn dân số năm 2012 là 5.718. Xã đƣợc chia làm 8 buôn, thôn bao gồm: Buôn Du, Buôn H’lang, Buôn H Yú, Buôn Y, Thôn Mới, Thôn Quỳnh 2, Thôn Quỳnh 3 và Thôn Cầu Đôi. Là một xã nằm cách trung tâm huyện (thị trấn Phú Túc) khoảng 15 km. Trong xã có một số hộ gia đình, thanh niên thƣờng xuyên đi vào rừng khai thác lâm sản, làm rẫy và bị mắc sốt rét trong khi ngủ ở rừng,
Uar Ia Rsai Chu Rcam Ia Dreh Ia Rmok Ia Mlah Chu Drang Dat Bang Ia Rsuom Chu Gu Krong Nang Chu Ngoc Phu Can PhuTuc N E W S
29
nhà rẫy. Đây là xã lƣu hành sốt rét nặng của huyện Krông Pa tỉnh Gia Lai.
* Xã Ia Mla’h, huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai
Xã Ia Mla’h có tọa độ: 13015’41”B và 108045’23”Đ nằm ở phía đông
huyện Krông Pa, phía bắc giáp xã Chƣ Rcăm, phía nam giáp xã Chƣ Ngọc, phía đông giáp xã Đất Bằng, phía tây giáp xã Chƣ Gu, thị trấn Phú Túc và xã Phú Cần. Dân tộc: Chủ yếu ngƣời Jrai và một ít ngƣời Kinh, Tày, Nùng. Xã có 8 thôn, buôn: Buôn Chính Đơn I, buôn Chính Đơn II, buôn Dù A, buôn Ơi Đăk, buôn Ơi Jit, buôn Prông, thôn Hòa Mỹ, thôn Xóm Kinh. Đời sống kinh tế rất khó khăn, đói quanh năm, ngƣời dân sống chủ yếu làm nƣơng rẫy, trồng sắn, ngô và một ít lúa nƣơng, ngoài ra một số ít làm lúa nƣớc. Hiện nay, do diện tích canh tác của đồng bào thiếu nên nhiều hộ gia đình vào rừng để phát rừng làm rẫy canh tác nông nghiệp và một số hộ dân vào rừng khai thác gỗ và các lâm sản khác. Thời gian làm việc và ngủ lại trong nƣơng rẫy của đồng bào thƣờng kéo khá dài đôi khi cả tuần.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Xác định tỷ lệ chết và tuổi thọ của Anopheles dirus và Anopheles
epiroticus sau khi đốt bò đƣợc tiêm Ivermectin ở phòng thí nghiệm.
- Xác định hiệu quả làm giảm thành phần loài và mật độ Anopheles khi
tiêm Ivermectin cho đàn bò ở thực địa.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
- Thử nghiệm hiệu lực của Ivermectin đối với muỗi nuôi trong PTN của
Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn.
- Nghiên cứu can thiệp có đối chứng tại thực địa, nhằm đánh giá hiệu lực
30
Theo số liệu điều tra của thú y huyện Krông Pa tại xã Ia Mla’h có 432 con bò tiêm Ivermectin và 371 con bò tiêm nƣớc muối, xã Chƣ Rcăm có 694 con bò tiêm Ivermectin và 469 con bò tiêm nƣớc muối
Tiến hành điều tra 4 đợt (6 đêm/đợt)
+ Đợt 1: Tháng 8 năm 2019 (trƣớc can thiệp). + Đợt 2: Tháng 9 năm 2019 (trƣớc can thiệp).
+ Đợt 3: Tháng 10 năm 2019 (sau can thiệp 7 ngày). + Đợt 4: Tháng 11 năm 2019 (sau can thiệp 50 ngày).
2.4.2. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu tại PTN
Kỹ thuật nuôi muỗi Anopheles
* Quy trình nuôi muỗi Anopheles
Trứng
+ Đặt 1 - 2 đĩa Petri có bông thấm nƣớc và giấy thấm cho muỗi đẻ vào lồng nuôi muỗi có muỗi cái sắp đẻ. Chú ý giữ cho giấy thấm luôn luôn ẩm.
+ Sau 1 - 2 ngày thu trứng trên giấy thấm. Trứng của Anopheles có thể
giữ không quá 5 ngày. Sau khi đẻ 3 - 5 ngày trứng đƣợc thả vào khay nƣớc với mức nƣớc từ 2 - 3 cm. Sau một ngày bọ gậy sẽ nở ra.
Bọ gậy
+ Mỗi khay thả từ 200 - 300 con bọ gậy. Trong thời gian đầu khi bọ gậy đang ở tuổi 1 mực nƣớc trong khay không quá 3 cm, khi bọ gậy sang tuổi 2, 3, 4 tăng dần lƣợng nƣớc trong khay.
+ Thức ăn: Bọ gậy tuổi 1 ăn nƣớc bột tôm hòa tan, mỗi ngày cho bọ gậy ăn 2 lần. Khi bọ gậy sang tuổi 2 có thể ăn hỗn hợp ngày 3 lần; số lƣợng thức ăn, số lần ăn tăng khi bọ gậy sang tuổi 4 (không cho bọ gậy ăn nhiều vì thức ăn thừa sẽ làm hỏng nƣớc nuôi). Dùng đầu tăm lấy thức ăn cho bọ gậy để không quá lƣợng quy định.
+ Trong trƣờng hợp nƣớc nuôi bọ gậy bẩn, có thể thay nƣớc cho bọ gậy hoặc dùng ống hút hút chất bẩn ra.
31
+ Hàng ngày thêm nƣớc vào khay nuôi bọ gậy. Nƣớc nuôi bọ gậy là nƣớc sạch, tuyệt đối không nhiễm hóa chất và các vi sinh vật ký sinh. Nên dùng nƣớc uống tinh khiết để nuôi bọ gậy, có thể dùng nƣớc máy nhƣng phải để 3 - 5 ngày cho chloramin trong nƣớc bay hơi.
Quăng
+ Dùng ống hút có miệng rộng để nhặt quăng từ khay nuôi bọ gậy cho vào chén. Đặt các chén này vào lồng nuôi muỗi.
+ Sau 1 - 2 ngày quăng lột xác thành muỗi, lấy các chén ra.
Muỗi
+ Dùng một miếng bọt biển tẩm dung dịch đƣờng Glucoza 10% và Polyvitamin đặt vào trong lồng nuôi muỗi. Thay bọt biển 2 ngày một lần.
+ Đặt các đĩa petri có giấy thấm nƣớc cho muỗi đẻ. + Muỗi trƣởng thành đƣợc cho ăn bằng máy Hemotek.
Kỹ thuật cho ăn nhân tạo
* Giai đoạn chuẩn bị
Màng ruột heo
Màng ruột heo tƣơi đƣợc xử lý sạch dƣới vòi nƣớc chảy để sử dụng hàng ngày, số còn lại sẽ đƣợc ƣớp với muối và bảo quản trong tủ lạnh. Thời gian bảo quản từ 5 - 7 ngày. Ruột heo đƣợc xử lý bằng cách cắt một miếng màng ruột heo hình vuông khoảng 6 cm rửa sạch bằng nƣớc máy, cạo bớt lớp màng bên trong giữ lại lớp biểu bì bên ngoài, màng càng mỏng thì khả năng đốt máu của muỗi qua màng càng cao. Dùng vòng chữ O cố định màng ruột heo vào nguồn chứa máu để bảo đảm màng đƣợc bịt kín. Kéo các góc, cạnh của màng cho tới khi màng căng và đều, tạo điều kiện tốt nhất cho muỗi đốt máu qua màng, dùng kéo cắt các phần màng dƣ.
Nguồn máu
32 đƣờng kính 5 mm, pipette Pasteur.
Máu đƣợc lấy từ máu heo.
Cho 200 ml máu heo tƣơi vào bình có thể tích 500 ml chứa 10 - 15 viên bi thủy tinh có đƣờng kính 5 mm đã qua khử trùng. Lắc bình liên tục khoảng 20 - 30 phút, cho đến khi ngừng nghe tiếng động từ các viên thủy tinh. Thành phần đông máu fibrin sẽ bám vào các hạt thủy tinh. Dùng pipette Pasteur hút máu nhẹ nhàng tránh va chạm các cục máu đông, cho vào chai mới sau đó vận chuyển chúng về Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn. Bảo quản máu đã đƣợc
khử fibrin trong tủ lạnh tại nhiệt độ -4oC, thời gian sử dụng từ 8 - 10 ngày.
* Quy trình thực hiện
- Dùng pipette Pasteur hoặc bơm tiêm, hút khoảng 5 ml máu nhỏ vừa đầy nguồn chứa máu đã đƣợc gắn màng, có thể thay đổi lƣợng máu trong nguồn chứa thông qua 1 trong 2 lỗ hở trên nguồn chứa máu.
- Bịt kín 2 lỗ chứa đầy máu bằng nắp nhựa trắng.
- Lau sạch những vết bẩn trên nguồn chứa máu, lắp ráp nguồn chứa máu vào Feeder.
Hình 2.2. Máy Hemotek sử dụng trong nuôi muỗi
- Gắn Feeder vào nguồn điện có hiệu điện thế 220 V có tác dụng làm ấm
và giữ máu ở nhiệt độ 35oC để muỗi ăn trong 4 giờ, nhiệt độ cao hơn 35o
C thì sẽ làm máu nhanh khô, cứ 30 phút thì lắc Feeder 1 lần.
33
máu từ nguồn chứa xuyên qua màng một cách dễ dàng.
Quy trình thử nghiệm thuốc Ivermectin đối với muỗi Anopheles
Bƣớc 1: Chuẩn bị bò
+ 1 con bò đƣợc sử dụng làm đối chứng không tiêm Ivermectin nhƣng đƣợc tiêm giả 1 liều nƣớc muối.
+ 1 con bò khác đƣợc dùng làm thử nghiệm đã đƣợc điều trị bằng thuốc diệt ký sinh trùng tiêu chuẩn trong vòng 2 tuần trƣớc khi điều trị bằng thử nghiệm với Ivermectin để đảm bảo loại bỏ bất kỳ ký sinh trùng nào còn sót lại trong cơ thể, tiêm 1 liều Ivermectin dƣới da với liều lƣợng 0,2 mg/kg trọng lƣợng cơ thể.
Bƣớc 2: Chuẩn bị dụng cụ để thử nghiệm
- Cốc nhựa (trong) thử nghiệm 12 cái đƣợc bịt một đầu bằng màn tuyn (cốc đƣợc đánh dấu ghi nhãn màu đỏ dùng cho thử nghiệm và cốc đánh dấu màu xanh dùng cho đối chứng), ống tuýp bắt muỗi, ống hút muỗi, khay đựng cốc thử nghiệm, bông khô, đồng hồ báo thức, khăn tủ muỗi, đƣờng glucose 10%, kéo, bút dầu, bút bi, mẫu ghi chép theo dõi thử nghiệm, sổ ghi chép...
Bƣớc 3: Bắt muỗi
Chọn những con muỗi cái đủ điều kiện thử nghiệm (muỗi 3 - 5 ngày tuổi, không bị gãy chân, cánh, khỏe mạnh), không hút đƣờng glucose 10% trong vòng 12 - 16 giờ. Bắt muỗi dùng ống tuýp thủy tinh đƣợc nút bông khô ở giữa, 1 đầu bắt một con muỗi đủ điều kiện thử nghiệm, 1 tuýp bắt 2 con và bắt tới khi đủ số lƣợng cần thiết thử nghiệm (kỹ thuật bắt muỗi khi bắt úp miệng ống trực tiếp lên con muỗi, khi thấy động muỗi trực tiếp bay vào trong lòng ống, bịt miệng tuýp bằng ngón tay trỏ sau đó dùng bông nút lại).
Bƣớc 4: Thả muỗi
Chuẩn bị 6 cốc thử nghiệm và 6 cốc đối chứng đƣợc đánh dấu theo thứ tự từ cốc 1 cho đến cốc 6. Mỗi cốc thả 20 cá thể muỗi trên 1 cốc tổng số muỗi thử nghiệm là 120 con và 120 muỗi đối chứng (kỹ thuật thả muỗi vào cốc
34
chọn 10 tuýp (20 cá thể muỗi) để sẵn từng cốc theo thứ tự, thả muỗi tay thuận cầm ống tuýp dùng ngón cái và ngón trỏ lấy bông nút ở tuýp ra dùng ngón tay thuận nút đầu tuýp lại sau đó cho vào lỗ cốc đã đƣợc đục sẵn đút ống tuýp vào, nghiêng ống tuýp và cốc 1 góc khoảng 30 - 45 độ, để muỗi bay từ tuýp qua cốc sau khi muỗi bay vào rút ống tuýp ra dùng bông khô nút lại), sau khi thả đủ số lƣợng các cốc thử nghiệm và đối chứng thì đem muỗi đi đốt bò thử nghiệm và đối chứng đã đƣợc cố định sẵn, tiến hành trong vòng 30 phút, đốt bò xong sử dụng ống hút muỗi để di chuyển các con muỗi đƣợc hút no máu sang ống nghỉ. Những con muỗi không hút no máu đƣợc loại bỏ không đem vào theo dõi.
Tổng một lô muỗi đƣợc theo dõi phải đạt từ 50% số muỗi no máu (60/120 cá thể muỗi đƣợc theo dõi) số muỗi cho đốt bò đƣợc no máu.
Muỗi theo dõi đƣợc tủ mát bằng khăn ƣớt, trong quá trình theo dõi muỗi
cho hút đƣờng glucozo 10%. Nhiệt độ phòng theo dõi (250
C - 270C ± 2), độ
ẩm tƣơng đối 70% ± 10.
Thời gian cho muỗi đốt bò thử nghiệm và đối chứng từ 17h đến 18h30.
Bƣớc 5: Theo dõi khả năng sống sót của muỗi trong 30 ngày, trong quá trình đó cần theo dõi nhiệt độ, độ ẩm cung cấp đầy đủ lƣợng đƣờng cho muỗi hút.
Quá trình thử nghiệm sẽ đƣợc thực hiện trong 5 đợt, đợt thứ nhất: sau 1 ngày bò đƣợc tiêm, đợt 2 sau 6 ngày, đợt 3 sau 13 ngày, đợt 4 sau 20 ngày và đợt 5 sau 28 ngày. Mỗi đợt thử nghiệm trong 3 ngày liên tiếp.
Tiêu chuẩn chọn mẫu thử nghiệm
Muỗi thử nghiệm là muỗi cái 3-5 ngày tuổi, cùng loài, khỏe mạnh, đầy đủ các bộ phận.
Cỡ mẫu thử nghiệm.
Muỗi thử nghiệm 240 muỗi cái khỏe mạnh, đƣợc hút cho vào 12 cốc mỗi ống 20 con. Trong đó 120 con làm thử nghiệm, 120 làm đối chứng.
35
Nhiệt độ phòng thử nghiệm: 25 ± 20C, độ ẩm tƣơng đối 70% ± 10.
Dụng cụ thử nhạy cảm:
- 12 ống nhựa: 6 cốc thực nghiệm, 6 cốc đối chứng, ống nghỉ.
- Khay đựng muỗi, ống hút muỗi, đƣờng glucozo 10%.
- Nhiệt độ, ẩm độ, các biểu mẫu ghi chép số liệu.
2.4.3. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu tại thực địa
Phƣơng pháp điều tra muỗi
* Thu thập muỗi bằng bẫy màn mồi gia súc
- Thời gian: 18 giờ đến 6 giờ sáng hôm sau.
- Vị trí đặt bẫy màn: Bẫy màn dùng gia súc làm mồi đƣợc đặt ngoài gần nhà, gần sát với vị trí mà gia súc thƣờng đƣợc giữ ở đó qua đêm.
- Chọn 1 con bò hiền lành dùng làm mồi, trƣớc khi mặt trời lặn, dùng dây thừng cột con bò đã chọn vào chiếc cọc đã đóng cố định xuống đất ở vị trí đặt bẫy.
- Treo bẫy màn trùm lên con bò làm mồi, khi treo màn lớn phải để mép dƣới cách mặt đất khoảng 15 - 20 cm để muỗi có thể bay vào trong màn lớn qua khoảng hở này. Để màn không bị gió thổi, phải cố định chân màn vào những chiếc cọc đã đóng chặt vào mặt đất.
- Tiến hành thu thập muỗi đậu trên màn mỗi giờ một lần. Sử dụng đèn pin soi tìm muỗi và dùng ống tuýp để bắt muỗi.
* Thu thập muỗi bằng mồi ngƣời màn kép
- Thời gian thu thập: 18 giờ tối đến 6 giờ sáng hôm sau.
- Thu thập muỗi trong nhà, dùng màn lớn phủ toàn bộ chiếc giƣờng, trên giƣờng có một ngƣời nằm làm mồi trong một chiếc màn cá nhân.
- Thu thập muỗi ngoài nhà, vị trí đặt bẫy màn cách nhà gần nhất khoảng 1 - 5 m, cách xa chuồng bò 30 m trở lên.
- Màn lớn đƣợc treo trên những chiếc cọc gỗ, bên trong màn lớn là một chiếc màn cá nhân và ngƣời làm mồi nằm trong chiếc màn cá nhân. Màn lớn khi treo cách mặt đất khoảng 15 - 20 cm để muỗi có thể bay vào màn lớn qua
36
khoảng hở này, để màn không bị gió thổi cần cố định chân màn vào những chiếc cọc đƣợc đóng chặt vào mặt đất.
- Tiến hành thu thập muỗi đậu trên màn, mỗi giờ bắt một lần, sử dụng