:
3.1.3. Sử dụng kỹ thuật LAMP xác định vi khuẩn E.coli O157:H7
Để có thể đánh giá, so sánh giữa các phƣơng pháp xác định và phát hiện vi khuẩn E. coli O157:H7, kỹ thuật LAMP đƣợc sử dụng để xác định vi khuẩn E.coli
O157:H7.
3.1.3.1.
Trên gen đích có 6 vùng bao gồm vùng F3/F3c, F2/F2c, F1/F1c ở đầu 3’ và vùng B1/B1c, B2/B2c, B3/B3c ở đầu 5’. Những trình tự này là cơ sở cho việc thiết kế 4 cặp mồi đặc biệt gồm hai mồi ngoài (F3 và B3) và hai mồi trong (FIP và BIP).
Những cặp mồi này thƣờng đƣợc thiết kế dựa trên phần mềm Primer Explorer V4. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Maruyama số bộ mồi tối thiểu cần để tiến hành là 1 cặp mồi BIP/FIP [52]. Chính vì vậy, bộ mồi của Maruyama đã đƣợc sử dụng trong nghiên cứu để làm sáng tỏ thêm vấn đề này. Trình tự và vị trí của cặp mồi đƣợc thể hiện trên hình 3.10.
VT2BIP: 5’-TGCTCTGGATGCATCTCTGGTCATATCTGGTTTCATCATATCTGGCG-3’ VT2FIP: 5’-GCGTTTTGTCACTGTCACAGCAGATAGCCTGACGAAATTCTCTCTGT-3’
Hình 3.10. Vị trí và trình tự cặp mồi FIP/BIP.
3.1.3.2. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn
DNA tổng số của vi khuẩn E. coli O157:H7 đƣợc tách chiết làm mẫu nghiên cứu, còn DNA của vi khuẩn E. coli ATCC đƣợc sử dụng làm đối chứng âm. DNA tổng số của hai chủng đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp của Sambrook và Russel có cải biến. Sau đó DNA tổng số đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.11). Kết quả nhận đƣợc trên hình 3.11 cho thấy ở cả hai đƣờng chạy đều chỉ xuất hiện 1 băng sáng, rõ nét, tuy nhiên vẫn còn băng phụ phía trên của băng DNA tổng số. Do vậy, cần tinh sạch DNA tổng số vi khuẩn trƣớc khi tiến hành thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.11. Hình ảnh điện di tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn.
1: DNA tổng số vi khuẩn E. coli O157:H7 2: DNA tổng số vi khuẩn E. coli ATCC
3.1.3.3. Phản ứng LAMP
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng LAMP.
M: Marker 1 kb
1: vi khuẩn E. coli O157:H7 2: vi khuẩn E. coli ATCC
Trong các phƣơng pháp phát hiện thì điện di trên gel agarose là thông dụng nhất. Sản phẩm LAMP là tổng hợp của nhiều đoạn DNA cuộn xoắn có các kích thƣớc khác nhau. Băng nhỏ nhất (nhỏ hơn 250 bp) tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen nằm giữa hai mồi ngoài. Nếu phản ứng LAMP âm tính thì không có đoạn DNA nào đƣợc tạo ra, sản phẩm của phản ứng sẽ dƣới dạng không có băng nào.
Kết quả nhận đƣợc trên hình 3.12 cho thấy phản ứng LAMP cho kết quả dƣơng tính với vi khuẩn E. coli O157:H7 (giếng 1) và âm tính với vi khuẩn E. coli
ATCC (giếng 2). Ở đƣờng chạy số 1 xuất hiện 1 dải băng dài với kích thƣớc nhỏ nhất dƣới 250 bp. Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết. Khi nhân PCR với cặp mồi ngoài, đoạn DNA thu đƣợc sẽ có kích thƣớc là 139 bp. Bên cạnh đó, ở đƣờng chạy số 2 không thấy xuất hiện dải băng, chứng tỏ phản ứng LAMP không xảy ra đối với vi khuẩn E. coli ATCC, điều này là phù hợp do trong DNA vi khuẩn
có thể nhận định, phản ứng LAMP vẫn có thể xảy ra trong trƣờng hợp chỉ sử dung 1 cặp mồi FIP/BIP.
Tiếp theo độ nhạy của phản ứng LAMP đối với hàm lƣợng DNA tối thiểu cần thiết để phản ứng dƣơng tính trong điều kiện thí nghiệm đƣợc tiến hành kiểm tra bằng cách đo OD và tính hàm lƣợng DNA có trong mẫu gốc, sau đó tiến hành phản ứng LAMP ở nhiều ở các mức độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.13.
Kết quả đo OD260nm mẫu DNA thí nghiệm (mẫu gốc, chƣa pha loãng) là 1,87. Ta có 1 unit OD260nm = 50 µg/ml, do vậy nồng độ DNA mẫu gốc = 1,87 x 50 µg/ml tƣơng ứng với 93500 pg/µl.
Quan sát hình ảnh điện di đồ trên hình 3.13 có thể nhận thấy, ở đƣờng chạy số 1 không thấy xuất hiện băng vạch nào chứng tỏ hàm lƣợng DNA với độ pha loãng 10-4 (tƣơng ứng với 9,35 pg/µl) là thấp, trong điều kiện thời gian thí nghiệm (1 giờ) kết quả phản ứng không đủ để quan sát bằng kỹ thuật điện di. Ở đƣờng chạy số 2, 3, 4, 5 đều đã xuất hiện dải băng, trong đó đƣờng chạy số 2 với dải băng mờ và còn chƣa rõ nét, đây cũng là phản ứng có nồng độ DNA thấp pha loãng 10-3 (93,5 pg/µl). Điều này chứng tỏ hàm lƣợng DNA ở nồng độ 93,5 pg/µl đã có thể để phản ứng LAMP xảy ra và quan sát đƣợc bằng điện di.
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm LAMP xác định hàm lƣợng DNA.
M: Marker 1kb 3: DNA pha loãng 10-2 1: DNA pha loãng 10-4 4: DNA pha loãng 10-1 2: DNA pha loãng 10-3 5: DNA pha loãng 100
Kích thƣớc DNA tƣơng ứng là = 9,35 pg x 0,978. 109= 9,144. 109 bp. 1 tế bào E. coli O157:H7 có 5,5. 106 bp, nhƣ vậy số lƣợng E. coli O157:H7 cần tối thiểu để phản ứng dƣơng tính trong thời gian 25 phút là:
9,144.109 bp 5,5.106 bp ≈ 166 tế bào
Nhƣ vậy, hàm lƣợng DNA 93,5 pg/µl (tƣơng ứng khoảng 166 tế bào) là thấp nhất để phản ứng cho kết quả dƣơng tính đối với điều kiện phòng thí nghiệm của chúng tôi.
Cùng với hàm lƣợng DNA tối thiểu cần thiết cho phản ứng LAMP, thời gian tối thiểu để phản ứng diễn ra cũng đã đƣợc khảo sát. Phản ứng LAMP đƣợc tiến hành trên máy PCR thông thƣờng, sau đó mẫu đƣợc lấy ở các thời điểm sau 15, 25, 30, 40 và 60 phút. Các mẫu này sẽ đƣợc điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra (kết quả không đƣợc thể hiện trên hình).
Sau khi phân tích hình ảnh và số liệu, kết quả nhận đƣợc cho thấy sau 15 phút tiến hành phản ứng, lƣợng sản phẩm tạo ra chƣa đủ để có thể phát hiện bằng kỹ thuật điện di. Sau 25 phút đã có thể quan sát sự xuất hiện sản phẩm của phản ứng thể hiện bằng các băng trên hình ảnh điện di đồ. Tuy nhiên, các băng vẫn còn mờ nhạt và chƣa đƣợc rõ ràng. Sau 30, 40 và 60 phút có thể quan sát rõ các băng trên điện di đồ. Nhƣ vậy, thời gian tối thiểu để có thể quan sát kết quả dƣơng tính thực hiện phản ứng LAMP là sau 25 phút.
3.1.3.4. Phát hiện sản phẩm LAMP
Cách đơn giản nhất để phát hiện sản phẩm của phản ứng LAMP là sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel agarose. Theo lý thuyết, sản phẩm của phản ứng sẽ đƣợc thể hiện dƣới dạng nhiều băng với các kích thƣớc khác nhau. Kết quả nghiên cứu nhận đƣợc hoàn toàn phù hợp với lý thuyết, tƣơng tự nhƣ điện di, khi thêm trực tiếp EtBr vào ống thí nghiệm và đối chứng, sau đó soi dƣới tia UV. Những mẫu dƣơng tính sẽ phát quang, còn những mẫu âm tính sẽ có độ sáng kém hơn (do còn DNA mẫu và DNA primers) (Kết quả không đƣợc thể hiện trên hình).
Một cách phát hiện sản phẩm LAMP bằng mắt thƣờng là sử dụng SYBR Green I. Phản ứng sau khi diễn ra, đƣợc bổ sung thêm 1% SYBR Green I. Các mẫu dƣơng tính sẽ cho màu xanh, còn các mẫu âm tính sẽ cho màu vàng chanh (Hình
3.14A). Có thể quan sát mẫu dƣơng tính đƣợc nhuộm SYBR Green I dƣới tia UV. Khi quan sát dƣới tia UV, mẫu dƣơng tính sẽ phát quang, còn mẫu âm tính sẽ không có mầu (Hình 3.14B)
Hình 3.14. Sản phẩm LAMP khi nhuộm bằng SYBR Green I.
A: Quan sát dƣới ánh sáng thƣờng; B: Quan sát dƣới tia UV 1: phản ứng âm tính
2: phản ứng dƣơng tính
Nhƣ vậy, có thể nhận định phản ứng LAMP có tính đặc hiệu đối với vi khuẩn
E. coli O157:H7. Đây là phƣơng pháp đƣợc tiến hành một cách nhanh, đơn giản, dễ sử dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh nhƣ vi khuẩn E. coli O157:H7. Vì vậy có thể sử dụng phản ứng LAMP trong thiết kế phát triển các kit xác định và phát hiện nhanh vi khuẩn E. coli O157:H7 trong các mẫu thực phẩm và nghiên cứu.
Thảo luận
Cho đến nay, việc xác định và phát hiện vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm phần lớn sử dụng kỹ thuật nuôi cấy trên môi trƣờng thạch. Kỹ thuật sinh học phân tử chỉ đƣợc sử dụng khi các nhà nghiên cứu cần phân loại chủng hoặc nghiên cứu sâu hơn về phân loại học. Các phƣơng pháp sinh học phân tử đòi hỏi kỹ thuật cao; lao động có tay nghề; phòng thí nghiệm và trang thiết bị hiện đại, hóa chất sử dụng phải tinh khiết với giá thành cao, một số kỹ thuật có thể gây độc đối với con ngƣời. Tuy nhiên, các phƣơng pháp này đƣợc tiến hành trong thời gian ngắn, tính chính xác cao, có thể phân biệt đƣợc các họ khác nhau trong cùng loài.
PCR là kỹ thuật đã đƣợc sử dụng từ lâu và thƣờng quy trong việc xác định và phân loại sinh vật đặc biệt là đối với gen 16S rRNA. So với các phƣơng pháp khác, phƣơng pháp này chính xác hơn và phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm.
Bên cạnh đó, quá trình khuếch đại và giải trình tự các gen độc tố cũng đƣợc tiếp cận sử dụng trong việc xác định các loại vi khuẩn gây độc. Tuy nhiên, đối với các độc tố nhƣ Shiga like toxin, có rất nhiều chủng vi khuẩn khác nhau gây độc, mà sự khác nhau giữa trình tự nucleotide của gen và trình tự amino acid của protein độc tố là không nhiều. Vì vậy, việc sử dụng các gen độc nhằm xác định vi khuẩn chỉ mang tính chất tƣơng đối và chỉ phân biệt đƣợc giữa những loài vi khuẩn gây độc tố và những loài vi khuẩn không gây độc. Nếu muốn phân biệt giữa các chủng gây độc với nhau cần sử dụng thêm các kỹ thuật phụ trợ khác.
Từ khi đƣợc mô tả đến nay, kỹ thuật LAMP đã đƣợc sử dụng rất nhiều trong nghiên cứu cũng nhƣ trong các kit xét nghiệm. Mặc dù có nhiều ƣu điểm nhƣ nhanh, đơn giản... nhƣng kỹ thuật này có một nhƣợc điểm là khó phân biệt đƣợc kết quả âm tính hay âm tính giả. Thông thƣờng phản ứng LAMP sẽ cho kết quả âm tính hoặc dƣơng tính, tuy nhiên nếu xảy ra hiện tƣợng âm tính giả thì rất khó để có thể phát hiện đƣợc. Chỉ những ngƣời có kinh nghiệm trong lĩnh vực này mới có thể phát hiện đƣợc sự khác nhau giữa âm tính và âm tính giả. Cũng giống nhƣ khi chúng ta sử dụng gen độc để xác định, phƣơng pháp chỉ có ý nghĩa trong việc xác định các chủng vi khuẩn trong các mẫu nghiên cứu và thực phẩm chứ không phân loại đƣợc các chủng này.
Nhƣ vậy, mỗi kỹ thuật đều có những điểm mạnh và điểm yếu khác nhau, tùy theo điều kiện cơ sở vật chất, mục đích… chúng ta có thể lựa chọn phƣơng pháp phù hợp cho việc phát hiện và phân loại vi khuẩn quan tâm. Trong thực tiễn nên có sự phối hợp các phƣơng pháp để có thể đƣa ra đƣợc kết luận chính xác nhất.