XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN

:

3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN

Hình 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm của luận án.

3.1. XÁC ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI O157:H7 BẰNG KỸ THUẬT GEN 3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích gen 3.1.1. Xác định chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật phân tích gen

mã hóa 16S rRNA

3.1.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn

Chủng E. coli O157:H7 đƣợc nuôi trong môi trƣờng LB lỏng, thu sinh khối tế bào và tách chiết DNA. Kết quả tách chiết DNA tổng số đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.2) nhằm đánh giá độ tinh sạch tƣơng đối của DNA tổng số thu đƣợc phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kết quả điện di cho thấy ở cả hai mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, không bị đứt gẫy và không có sản phẩm phụ chứng tỏ DNA tổng số đƣợc tách chiết từ vi khuẩn E. coli O157:H7 có độ tinh sạch cao.

sưu p ng vi u n c nh ng gen 16S rRNA t n ng gen c Stx t n ng k u t LAMP ng vi u n E. Coli O157:H7 T ư n Griffin. 1 Gen a ng ng c Protein ng T nh c u a ng T o ng & u n gen m tra

Hình 3.2. Hình ảnh điện di tách DNA tổng số của vi khuẩn E. coli O157:H7.

Mẫu 1: E. coli O157:H7 số 1 Mẫu 2: E. coli O157:H7 số 2

3.1.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa 16S rRNA

Sau khi tách chiết DNA tổng số, gen mã hóa 16S rRNA sẽ đƣợc nhân bản với cặp mồi đặc hiệu 16S rRNA-F/16S rRNA-R. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.3).

Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA.

Marker: Marker 1kb

Mẫu 1: E. coli O157:H7 số 1 Mẫu 2: E. coli O157:H7 số 2

Kết quả trên hình 3.3 cho thấy, sản phẩm PCR của cả 2 mẫu đều là 1 băng đặc hiệu có kích thƣớc khoảng 1,5 kb phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và đủ tiêu chuẩn để tiến hành các thí nghiệm tiếp

theo. Để khẳng định xem đoạn gen nhân đƣợc đƣợc có phải là gen mã hóa 16S rRNA hay không, sản phẩm PCR đƣợc tiến hành tách dòng và xác định trình tự.

3.1.1.3. Biến nạp plasmid tái tổ hợp mang gen 16S rRNA vào tế bào E. coli

DH5α

Quá trình tách dòng và xác định trình tự sản phẩm PCR nhân gen mã hóa 16S rRNA đƣợc thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT. Vector pBT có chứa các gen kháng kháng sinh Amp, gen mã hóa LacZ, vì vậy khi nuôi trên môi trƣờng có kháng sinh Amp, X-gal những vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pBT gắn gen lạ sẽ có khuẩn lạc màu trắng. Vi khuẩn mang vector pBT không có gen lạ có khuẩn lạc màu xanh. Để khẳng định các khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có gen 16S rRNA hay không, plasmid tái tổ hợp sẽ đƣợc tách chiết và cắt kiểm tra bằng enzyme BamHI.

3.1.1.4. Tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp

Để kiểm tra kết quả gắn sản phẩm PCR vào vector pBT và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH5α, một khuẩn lạc xanh và 4 khuẩn lạc trắng đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên, nuôi trong 2ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh Amp (100 µg/ml) lắc qua đêm ở 37°C, 200 v/p. Sau đó plasmid đƣợc tách chiết và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.4).

Hình 3.4. Hình ảnh điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA plasmid.

DC: khuẩn lạc xanh 1-4: khuẩn lạc trắng

Thông thƣờng sau khi điện di sản phẩm tách plasmid sẽ thu đƣợc ba băng tƣơng ứng với ba dạng tồn tại của plasmid: băng thấp nhất ứng với các plasmid ở trạng thái siêu xoắn, băng thứ hai ứng với các plasmid ở trạng thái xoắn, băng thứ ba ứng với plasmid ở trạng thái bình thƣờng. Kết quả trên hình 3.4 cho thấy các giếng 1, 2 đều thu đƣợc 3 băng rõ, giếng 3 thu đƣợc 2 băng và giếng 4 thu đƣợc 3 băng. Mặt khác theo lí thuyết phân tử DNA nào có kích thƣớc càng lớn thì khi điện di trên gel agarose chúng sẽ di chuyển càng chậm. Nhƣ vậy, các vector đƣợc gắn sản phẩm PCR thì sẽ có khối lƣợng lớn hơn, do đó chạy chậm hơn so với vector gốc. Từ kết quả điện di có thể nhận định các vector ở các giếng số 1-3 có thể là các vector mang gen mong muốn, băng điện di ở giếng số 4 cao hơn so với ở đƣờng chạy số 1 nhƣng không bằng các băng ở đƣờng chạy số 1, 2 và 3 do vậy đây có thể không phải vector mang gen đích. Để chứng minh nhận định trên, 4 mẫu DNA plasmid số 1-4 của các dòng khuẩn lạc này sẽ đƣợc cắt kiểm tra bởi enzyme BamHI.

3.1.1.5. Kiểm tra các dòng plasmid bằng enzyme cắt giới hạn BamHI

Hình 3.5. Hình ảnh điện di kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn BamHI.

Marker: Marker 1kb

Mẫu 1- mẫu 4: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng

Thành phần phản ứng cắt các plasmid đã đƣợc chọn với enzyme giới hạn

BamHI đƣợc trình bày ở Chƣơng 2. Sản phẩm cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Theo tính toán lý thuyết, các DNA plasmid mang gen quan tâm khi đƣợc cắt bằng BamHI sẽ cho 2 băng với các kích thƣớc khoảng 2,7 kb (tƣơng ứng

kích thƣớc của vector pBT) và khoảng 1,5 kb (tƣơng ứng với kích thƣớc gen 16S rRNA). Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên hình 3.5.

Trên điện di đồ hình 3.5 cho thấy các mẫu 1, 2, 3 (tƣơng ứng với các mẫu 1- 3 trên hình 3.4) đều xuất hiện hai băng: một băng có kích thƣớc khoảng 1,5 kb và một băng có kích thƣớc khoảng 2,7 kb phù hợp với tính toán lý thuyết, riêng mẫu số 4 (tƣơng ứng với mẫu số 4 trong hình 3.4) xuất hiện băng có kích thƣớc thấp hơn 1,5 kb do vậy dòng này không mang gen mong muốn. Đến đây có nhận thấy các dòng tế bào 1, 2, 3 mang vector tái tổ hợp. Để chắc chắn gen mã hóa cho 16S rRNA đã đƣợc tách dòng, các plasmid tái tổ hợp sẽ đƣợc tách chiết với số lƣợng lớn và đƣợc tinh sạch để sử dụng cho phản ứng xác định trình tự.

3.1.1.6. Xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA

Sau khi tách chiết và tinh sạch DNA plasmid, gen 16S rRNA đƣợc xác định trình tự theo nguyên tắc của F. Sanger và cộng sự (1977) [84], sử dụng cặp mồi M13 của vector trên máy xác định trình tự tự động. Kết quả xác định trình tự đƣợc trình bày ở Phụ lục 1 và 2.

Đoạn gen đã tách dòng có kích thƣớc 1499 bp. Kết quả so sánh trình tự với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm FASTA (http://www.ebi.ac.uk/) cho thấy, trình tự nucleotide của đoạn gen thu nhận đƣợc có độ tƣơng đồng cao (trên 99%) với trình tự gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 khác nhau (Bảng 3.1). Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng chủng vi khuẩn đã nuôi cấy chính là E. coli O157:H7.

Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự gen HQ658163 với các trình tự gen 16S rRNA từ GenBank

Alignment DB:ID Source Length Identity

%

Similar

% Overlap

1 EM_PRO:AB035923 Escherichia coli O157:H7 yrd 6560 99.4 99.4 1500

2 EM_PRO:AB035926 Escherichia coli O157:H7 yae 7017 99.4 99.4 1500

3 EM_PRO:AB035922 Escherichia coli O157:H7 yie 6851 99.3 99.3 1500

4 EM_PRO:EU118103 Escherichia coli strain O157 1542 99.3 99.3 1500

6 EM_PRO:DQ337505 Escherichia sp. BBDP27 16S r 1503 99.3 99.3 1500

7 EM_PRO:BA000007 Escherichia coli O157:H7 str 5498450 99.4 99.4 1500

8 EM_PRO:AE005174 Escherichia coli O157:H7 EDL 5528445 99.4 99.4 1500

9 EM_PRO:BA000007 Escherichia coli O157:H7 str 5498450 99.4 99.4 1500

10 EM_PRO:AB035924 Escherichia coli O157:H7 pur 6811 99.3 99.3 1500

Từ kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của các chủng E. coli

O157:H7 và các chủng vi khuẩn khác có độ tƣơng đồng cao, sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E. coli O157:H7 và loài khácđã đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm MEGA 4.0 (Hình 3.6).

Hình 3.6. Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ giữa E. coli O157:H7 với chủng khác đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự gen 16S RNA của chủng E. coli O157:H7

nghiên cứu (mã số HQ658163) và các chủng khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế.

Chủng E. coli O157:H7 tách dòng đƣợc có độ tƣơng đồng cao với các chủng

E. coli O157:H7 khác trên Ngân hàng Gen Quốc tế trong đó cao nhất với chủng E. coli O157:H7 mã số AB035923 (99,4%). Kết quả so sánh trình tự với chủng E. coli

O157:H7 mã số AB035923 đƣợc thể hiện ở Phụ lục 3. So với các chủng vi khuẩn khác nhƣ E. coli chủng WD01, AE1-2... chủng vi khuẩn E. coli O157:H7 phân lập đƣợc độ tƣơng đồng khoảng 99%. Trình tự gen 16S rRNA mới đƣợc xác định này đã đƣợc đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số HQ658163. Sau khi xác

định vi khuẩn E. coli O157:H7 bằng phƣơng pháp phân tích gen 16S rRNA, hai gen độc tố Stx1 và Stx2 của vi khuẩn này cũng đƣợc tiến hành phân tích.

3.1.2. Sử dụng đoạn gen Stx1 và Stx2 để xác định E. coli O157:H7 3.1.2.1. Nhân bản đoạn gen Stx1 và Stx2 3.1.2.1. Nhân bản đoạn gen Stx1 và Stx2

Gen Stx1 và Stx2, đƣợc khuếch đại từ DNA tổng số của E. coli O157:H7 sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu tƣơng ứng là Stx1F/Stx1R và Stx2F/Stx2R. Đối chứng âm đƣợc dùng là vi khuẩn DH5α. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.7).

Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx1 và Stx2.

M: marker 1kb

1: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R đối với E. coli DH5α

2: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R đối với E. coli DH5α

3: PCR với cặp mồi Stx1F/Stx1R đối với E. coli O157:H7

4: PCR với cặp mồi Stx2F/Stx2R đối với E. coli O157:H7

Kết quả điện di trên hình 3.7 cho thấy ở giếng số 1 và 2 không xuất hiện băng chứng tỏ E. coli DH5α không mang gen độc. Giếng số 3 xuất hiện một băng có kích thƣớc khoảng 180bp, tƣơng ứng với kích thƣớc của gen Stx1 theo tính toán lý thuyết. Ở giếng số 4 có một băng vạch sáng đậm có kích thƣớc khoảng 200 bp phù hợp với kích thƣớc của gen Stx2 nhƣ tính toán theo lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét. Tiếp theo, sản phẩm PCR đƣợc tiến hành tách dòng và xác định trình tự.

3.1.2.2. Chọn dòng gen Stx1 và Stx2 trong vector pJET1.2/blunt

Sản phẩm PCR nhân hai gen Stx1 và Stx2 đƣợc tách dòng và xác định trình tự bằng cách gắn trực tiếp vào vector pJET1.2/blunt, sau đó sản phẩm lai đƣợc biến

nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α không có độc tố Shiga toxin và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung Ampicillin (100 µg/ml). Vector pJET1.2/blunt là một vector tách dòng dùng trong các nghiên cứu kỹ thuật di truyền có kích thƣớc 2974 bp. Vector này có vị trí tách dòng là đầu bằng, điều này làm tăng khả năng tách dòng của vector lên nhiều lần vì nó không phụ thuộc vào các trình tự giới hạn và hiệu quả cắt của các enzyme.

Với đặc điểm vector pJET1.2/blunt chỉ tách dòng các đoạn gen đầu bằng, do vậy Taq polymerase không sử dụng làm enzyme tổng hợp sản phẩm PCR, thay vào đó là Pfu polymerase của vi khuẩn Pyrococcus furiosis. Enzyme này có nhiều ƣu điểm hơn Taq polymerase thứ nhất là không gắn thêm một nucleotide adenine vào đầu 3’ của gen và thứ hai không có hoạt tính 5’-3’ exonuclease. Nhờ đặc điểm này sản phẩm PCR do Pfu polymerase tổng hợp sẽ có đầu bằng và mồi không bị phân hủy trong quá trình phản ứng.

Để chọn đƣợc dòng mang plasmid tái tổ hợp mong muốn, plasmid của một số khuẩn lạc đối với từng gen sẽ đƣợc tách chiết và kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi của vector pJET1.2. Cặp mồi này sẽ khuếch đại đoạn trình tự nằm giữa vị trí đã tách dòng.

Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen Stx1 với cặp mồi vector pJET.

M: Marker 1kb

Đối với Stx1, 2 dòng vi khuẩn đƣợc tách plasmid và chạy PCR. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% (Hình 3.8) cho thấy cả hai giếng đều có 1 băng có kích thƣớc khoảng 250 bp, tƣơng ứng với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, rõ nét và không có sản phẩm phụ.

Đối với gen Stx2, 5 dòng vi khuẩn đƣợc tách chiết plasmid và chạy PCR kiểm tra (Hình 3.9).

Hình 3.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen Stx2 với cặp mồi vector pJET

M: marker 1kb

1-5: dòng khuẩn lạc số 1-5

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Stx2 trên gel agarose 1% trên hình 3.9 cho thấy các giếng số 1, 2, 4, 5 đều có 1 băng vạch sáng, rõ nét có kích thƣớc khoảng 300 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết. Riêng giếng số 3 không xuất hiện băng sản phẩm PCR, nhƣ vậy, có thể kết luận các dòng khuẩn lạc số 1, 2, 4, 5 có khả năng mang gen Stx2.

Để khẳng định kết quả tách dòng đối với 2 gen Stx1 và Stx2, plasmid của dòng số 1 mang gen Stx1 và dòng số 5 mang gen Stx2 đƣợc tinh sạch và giải trình tự.

3.1.2.3. Xác định trình tự đoạn gen Stx1 và Stx2

Xác định trình tự đoạn gen Stx1

Kết quả xác định trình tự (Phụ lục 4) cho thấy đoạn gen Stx1 có kích thƣớc là 150 bp, nằm ở tiểu phần A, tiểu phần có vai trò nhƣ một enzyme N-glycosidase. Kết

tế bằng phần mềm phân tích độ tƣơng đồng BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih) cho thấy, trình tự nucleotide thu đƣợc có độ tƣơng đồng đến 99% với các trình tự của đoạn gen Stx1 trong genome của các chủng vi khuẩn E. coli khác và với vi khuẩn

Shigella dysenteriae (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Kết quả so sánh trình tự gen Stx1 với các trình tự gen Stx1 từ GenBank

Description Max score Total score Query cover E

value Ident Accession

Escherichia coli strain EC169 antitermination protein Q (q), Shiga toxin 1 subunit A (Stx1A), and Shiga toxin 1 subunit B (Stx1B) gens, complete cds

270 270 99% 2e-69 99% JQ327854.1

Shigella dysenteriae Shiga toxin subunit A (StxA) gen,

partial cds 270 270 99% 2e-69 99% HM017965.1

Escherichia coli O26:H11 str. 11368 DNA, complete genome 270 270 99% 2e-69 99% AP010953.1

Escherichia coli strain N13844 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds

270 270 99% 2e-69 99% GQ429159.1

Escherichia coli strain N11355 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds

270 270 99% 2e-69 99% GQ429158.1

Escherichia coli strain N11354 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds

270 270 99% 2e-69 99% GQ429157.1

Escherichia coli strain N2688 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A) and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds

270 270 99% 2e-69 99% GQ429156.1

Escherichia coli strain 22813 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A)

and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds 270 270 99% 2e-69 99% GQ429155.1

Escherichia coli strain 20177 Shiga toxin 1 A subunit (Stx1A)

and Shiga toxin 1 B subunit (Stx1B) gens, complete cds 270 270 99% 2e-69 99% GQ429154.1

Escherichia coli strain EC108 Shiga toxin 1A subunit (Stx1A)

and Shiga toxin 1B subunit (Stx1B) gens, partial cds 270 270 99% 2e-69 99% EU754740.1

Kết quả phân tích, so sánh với trình tự gen Stx1 của vi khuẩn Shigella dysenteriae

nhƣ sau:

Shigella dysenteriae Shiga toxin subunit A (StxA) gen, partial cds Sequence ID: gb|HM017965.1|Length: 955 Number of Matches: 1

Score= 270 bits(146) Expect =2e-69 Identities = 149/150(99%) Gaps = 1/150(0%) Strand=Plus/Plus

Query 1 ATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTATCA-TCATCAG 59 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 240 ATCTATCCCTCTGACATCAACTGCAAACAAATTATCCCCTGTGCCACTATCAATCATCAG 181

Query 60 TAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCAGAGCGAATGAC 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 180 TAAAGACGTACCTCCTGATGAAATAGTCTGTAATGGAGTACCTATTGCAGAGCGAATGAC 121 Query 120 ATTCAGCGAATCTACATACGTCTTTGCAGT 149 |||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 120 ATTCAGCGAATCTACATACGTCTTTGCAGT 91 Xác định trình tự đoạn gen Stx2

Kết quả phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen Stx2 đƣợc trình bày trong Phụ lục 5. Đoạn gen Stx2 thu đƣợc có kích thƣớc là 205 bp, cũng nằm ở tiểu phần A. Trình tự nhận đƣợc đƣợc so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen Quốc tế bằng phần mềm phân tích độ tƣơng đồng BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih). Kết quả nhận đƣợc cho thấy trình tự nucleotide thu đƣợc có độ tƣơng đồng 99% với các trình tự của đoạn gen Stx2 của E. coli O157:H7 và các chủng vi khuẩn E. coli khác.

Bảng 3.3. Kết quả so sánh trình tự gen Stx2 với các trình tự gen Stx2 từ GenBank

Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident

GU983683.1 Escherichia coli Stx2 A subunit variant h (Stx2A) and

Stx2 B subunit variant h (Stx2B) gens, complete cds 370 370 100% 2e-99 99%