4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án
3.1.3. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc
Sau khi khử trùng hạt (Hình 4A), các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn
Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình 4B- 4C). Có lắc
nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
Mỗi mẫu nửa lá mầm sau khi lây nhiễm mẫu cấy được chia đặt đều trên giấy lọc vô trùng trên CCM rắn trong đĩa Petri (đường kính 90 mm x sâu 15 mm) Mẫu đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng /tối) trong 5 ngày (Hình 10A).
Sau thời gian đồng nuôi cấy CCM 5 ngày, các mẫu cấy có chuyển xanh (Hình 10B) được đưa vào cấy (nghiêng 45 độ) trong môi trường cảm ứng tái sinh chồi SIM lần 1 trong 14 ngày và được duy trì ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối (Hình 10D).
Hai tuần sau, các mẫu cấy được cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn (Hình 7D). Duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. Các chồi chết là các chồi không chứa gen biến nạp.
38
Bác chồiError! Bookmark not defined.9 KSEQ Bồi chết là các chồi không chứa gen biến nạp.chuyển sang môi trường Cúc Hà B c thông qua vi khu
c A. tumefaciens Lần thí
nghiệm Số mẫu
Số lượng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi (%) CCM SIM1 Lần 1 100 88 72 81.82 Lần 2 100 91 75 82,41 Lần 3 100 93 62 66,67 Lần 4 100 87 66 75,86 Lần 5 100 92 71 77,17 Lần 6 100 78 59 75,64 Lần 7 100 84 62 73,80 Lần 8 100 92 57 61,96 Lần 9 100 68 55 80,89 Lần 10 100 77 43 55,84 Tổng cộng 1000 766 622 81,20
Qua kết quả bảng 3.9 ta thấy:
Sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen tổng số 1000 mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1.Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được 766 mẫu sống sót.
Với số mẫu tạo chồi là 622 sau 14 ngày tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen lần thứ nhất trên môi trường SIM1 có chứa 10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở đậu tương Cúc Hà Bắc đạt 81,20% chứng tỏ bước đầu biến nạp đã thành công.
39
Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở đậu tương Cúc Hà Bắc đạt 81,20% cao nhất so với ở giống Cọc chùm (71,12%) và DT22 (68,05%).
Hình 10. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens
Ghi chú:
(A) Mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc đồng nuôi cấy trên môi trường CCM;
(B) Mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc đồng nuôi cấy trên môi trường CCM sau
5 ngày;
(C)Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 1; (D)Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 2.
A B
40
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn lọc trên môi trường SIM2 có chứa 5 mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng kéo dào chồi SEM. Chồi tái sinh có kích thước khoảng 4 cm (Hình 11A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để phát triển thành cây hoàn chỉnh (Hình 11B).
Hình 11. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ
Ghi chú:
(A) Hình ảnh cây Cúc Hà Bắcchuyển gen tái sinh trên môi trường SEM;
(B);Cây chuygen tá ra rhuygen tái sinh trên môi trường SEM;rễ ;
Bảng 3. 310 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens Lần thí
nghiệm
Số lượng mẫu Tỷ lệ sống sau chọn lọc bằng kháng sinh (%) SIM2 SEM RM Lần 1 69 11 2 15,94 Lần 2 71 9 1 12,67 Lần 3 62 4 0 6,45 Lần 4 66 7 1 10,60 Lần 5 71 7 2 9,86 Lần 6 52 5 2 9,61 A B
41 Lần 7 62 3 3 4,84 Lần 8 56 2 3 3,57 Lần 9 53 6 1 11,32 Lần 10 43 4 0 9,30 Tổng cộng 605 59 15 9,75
Kết quả chọn lọc từ 605 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 59 chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,75%), số chồi đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ là 15 chồi (Bảng 3.10, Hình 11).
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho đến khi trưởng thành .Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đã thu được 11 cây đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà lưới (Hình 12). Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và PCR.
Bảng 3. 411 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông
qua vi khuẩn A. tumefaciens Lần thí nghiệm Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ
trên môi trường RM
Số cây sống sót sau khi ra đất Lần 1 2 2 Lần 2 1 1 Lần 3 0 0 Lần 4 1 0 Lần 5 2 2 Lần 6 2 2 Lần 7 3 2 Lần 8 3 1
42
Lần 9 1 1
Lần 10 0 0
Tổng cộng 15 11
Hình 12. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Bthông qError! Bookmark not defined.12 K2EQ B qchuy B qua vi khuẩn A. tumefaciensCúc Hà Bua thông qua vi khuuẩn A. tumefacien Lần thí nghiệm Số mẫu biến nạp (mẫu) Số cây sống sót sau khi ra đất Số cây sống sót sau khi phun kiểm tra basta
Hiệu suất biến nạp (%) Lần 1 72 2 1 1,38 Lần 2 75 1 1 1,33 Lần 3 62 0 0 0 Lần 4 66 0 0 0 Lần 5 71 2 0 0
43 Lần 6 59 2 1 1,69 Lần 7 62 2 0 0 Lần 8 57 1 1 1,75 Lần 9 55 1 1 1,82 Lần 10 43 0 0 0 Tổng cộng 622 11 5 0,8
Qua kết quả bảng 3.12 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen cấu trúc pER10-pUBQ14:CBF1 với 622 mẫu đậu tương Cúc Hà Bắc được biến nạp thu được 11 cây chuyển gen T0 sống sót.
Kết quả sàng lọc bằng thuốc trừ cỏ basta thu được 5 cây kháng thuốc. Hiệu suất chuyển gen đạt 0,8% cao nhất trong ba giống đậu tương được sử dụng cho chuyển gen (Cọc chùm 0,48% và DT22 0,56%).
Hình 13. Hình ảnh sàng lọc cây chuyển gen sau 3 ngày bằng Basta
Ghi chú:
44
(B) lá cây chuyển gen CBF1 kháng lại Basta. Vạch kẻ ngang giữ lá chỉ vị
chí quét Basta để sàng lọc cây chuyển gen
(C) Cây chuyển gen được sàng lọc bằng phương pháp phun Basta. Mũi
tên chỉ cây không chuyển gen bị chết do không có khả năng kháng Basta.