4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.Phương pháp biến nạp gen vào đậu tương
Gen CBF1 được chuyển vào giống DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefacience. Quy trình thực hiện sử dụng phương pháp nửa hạt có cải tiến (half- seed) của Magie M. Paz và cộng sự (2006) [39].
Số mẫu biến nạp 100 mẫu/lần biến nạp. Mẫu biến nạp được nuôi cấy trên đĩa petri, 5-7 mẫu/đĩa trong điều kiện 25OC, 16/8 giờ sáng/tối. Thành phần môi trường nuôi cấy được trình bày chi tiết ở phần phụ lục. Biến nạp gen bằng phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefacience được thực hiện theo sơ đồ hình 3 dưới đây:
19
Hạt đậu tương Chủng vi khuẩn A. tumefacience Khử trùng bề mặt Nuôi lỏng tạo dịch huyền phù
Gây tổn thương nách lá mầm, sau đó lây nhiễm 30 phút trong dịch khuẩn Đồng nuôi cấy trên CCM trong 5 ngày
Cảm ứng tạo chồi trên SIM (4 tuần)
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM Ra rễ trên RM
Ra cây
2.4.2.Phương pháp chuẩn bị mẫu đậu tương.
Hạt đậu tương trưởng thành không có bất kỳ khuyết tật nào được lau sạch bằng vải bông (được làm ướt bằng cồn 75%), sau đó khử trùng bề mặt trong 16 giờ bằng khí clo (100 ml NaClO + 10 ml HCl hoặc 100 ml NaClO + 3,5 ml HCl) trong một buồng kín. Để có được mẫu cấy một lá mầm nửa hạt, các hạt đã khử trùng được ngâm trong nước vô trùng ở 23°C dưới bóng tối trong 16 -18 giờ.
2.4.3.Biến nạp gen thông qua Agrobacterium tumefaciens Hình 3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương
20
(A). Tạo dịch huyền phù Agrobacterium tumefaciens
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid quan tâm được cất giữ trong glycerol ở -200C. Nuôi lắc vi khuẩn trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh tương ứng, nuôi ở 280C trong 20 giờ (lắc 200 vòng/phút). Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy quang phổ ở bước sóng 600nm (OD600). Ly tâm dịch khuẩn ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Cặn tế bào được làm loãng trong 50 ml môi trường lỏng lây nhiễm CCM (phục lục thành phần môi trường) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 40- 60 phút trước khi biến nạp.
(B). Lây nhiễm vi khuẩn
Các hạt có vỏ bọc được dùng dao cắt theo chiều dọc của hilum, và các lớp vỏ hạt được loại bỏ. Các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút. Có lắc nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút). Sau đó đặt mẫu vừa lây nhiễm vào đĩa petri chứa môi trường lây nhiễm bán rắn CCM. Mẫu đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối trong 5 ngày.
(C). Tạo chồi
Sau quá trình đồng nuôi cấy, các mẫu đậu tương được rửa nhanh bằng môi trường tạo chồi lỏng SIM (phục lục thành phần môi trường) có bổ sung kháng sinh Cefotaxime để ức chế sự phát triển của vi khuẩn (kết hợp lắc nhẹ). Sau đó mẫu được cấy trên môi trường rắn tạo chồi (SIM) lần thứ nhất có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn trong khoảng 14 ngày. Cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn, duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen.
21
(D). Kéo dài chồi
Tách riêng biệt các chồi từ cụm chồi thu được chuyển sang môi trường kéo dài SEM (phụ lục thành phần môi trường).) có bổ sung chất chọn lọc thích hợp để tái sinh chồi. Nuôi 4 tuần ở chế độ 250C, với 18/6h sáng/tối. Trong thời gian này chia làm hai lần cấy chuyển.
(E). Tái sinh cây biến nạp gen hoàn chỉnh
Khi chồi phát triển có chiều dài khoảng trên 4 cm được chuyển sang môi trường tạo rễ RM (phụ lục thành phần môi trường) nuôi sáng ở 250C, thời gian từ 2-3 tuần.
(F). Chuyển cây ra đất
Cây tái sinh trên môi trường RM có 3-4 rễ, cao 3-4 cm được chuyển ra đất trồng.