4. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án
2.5. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen
Đánh giá đậu tương chuyển gen bằng chất diệt cỏ Basta.
Các cây con được trồng trong bầu đất, sau 2 – 3 tuần khi cây đủ ba lá tiến hành phun Basta 2 lần liên tiếp, mỗi lần cách nhau 3 ngày với nồng độ glufosinate 10 mg/L. Sau 2 lần phun, quan sát sự biểu hiện của cây, thu mẫu lá của cây con còn sống để tách chiết DNA.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ lá đậu tương
Khi cây có lá thứ 5 thì tiến hành thu mẫu lá để tách chiết DNA. DNA được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Tách chiết DNA từ lá đậu tương
-Bước 1: Nghiền 0,3-0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn. -Bước 2: Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút.
22
-Bước 3: Ủ các ống ly tâm ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
-Bước 4: Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại 2 lần).
-Bước 5: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
-Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 µl NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ - 200C qua đêm.
-Bước 7: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
-Bước 8: Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần).
-Bước 9: Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (20 phút).
-Bước 10: Bổ sung 30 µl H2O + 1 µl RNase sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200C.
Phương pháp phân tích PCR các cây biến nạp gen
Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi gen bar và CBF1 xác định sự có mặt của gen CBF1. Trình tự cặp mồi được trình bày ở mục 2.1.2:
Hỗn hợp phản ứng bao gồm: -H2O 12µl -Dung dịch đệm PCR 10X 2,0 µl -MgCl2 (50 mM) 1,0 µl -dNTP (1 mM) 2,5 µl -Mồi xuôi (50 ng/µl ) 0,5 µl
23 -Mồi ngược (50 ng/µl ) 0,5 µl -Tag-polymerase (5UI/µl ) 0,5 µl -DNA (25 ng/µl ) 1 µl Tổng thể tích phản ứng 20 µl Chương trình chạy như sau:
-940C trong 2 phút -940C trong 1 phút
-550C trong 45 giây 35 chu kỳ -720C trong 1 phút
-720C trong 10 phút -40C
Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose nồng độ 1%
Chuẩn bị bản gel:
-Chuẩn bị khay điện di, lau khô, cài lược, chỉnh cho cân bằng.
Chuẩn bị gel agarose 1%, đưa vào lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch 1xTBE. Để hỗn hợp giảm nhiệt độ xuống còn 50-600C, bổ sung ethidium bromide rồi đổ vào khay điện di.
Sau khoảng 45-60 phút gel đông lại, rút lược khỏi bản gel. Đặt khay vào bể điện di, bổ sung thêm dung dịch 1xTBE cho ngập mặt gel.
Tra mẫu DNA:
Lấy 2µl đệm tra mẫu, thêm vào 8µl DNA sản phẩm, trộn đều rồi tra vào các giếng. Tra thêm DNA marker 1 kb vào giếng đầu tiên để xác định độ dài của các băng DNA.
Lắp nguồn điện vào bể điện di, chỉnh điện thế từ 85-100V trong khoảng 45 phút đến 1 giờ. DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương của điện trường. Dựa vào vị trí của các vạch màu để dừng quá trình điện di
24
Nhuộm bản gel và chụp ảnh: Gel được soi dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 245-260 nm của máy soi và chụp ảnh bản gel bằng máy CLS-Microdoc (Clever Scientific Ltd)
2.6. Các chỉ tiêu đánh giá
Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp phản ánh các yếu tố làm ảnh hưởng tới quá trình biến nạp. Tỷ lệ mẫu sống sau biến nạp được tính như sau:
Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%) = Số mẫu kéo dài chồi ×100 % Tổng số mẫu đa chồi
Tỷ lệ mẫu đa chồi đậu tương (%) = Số mẫu sống sót sau chọn lọc ×100 % Số mẫu đưa vào chọn lọc
- Hiệu quả chuyển nạp gen thông qua chất chọn lọc thực vật: Số cây sống
Hiệu suất chuyển gen = x 100 (%)
Tổng số chồi chọn lọc
Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học và phần mềm Microsolf Excel.
25
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Nghiên cứu biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. tumefaciens được tiến hành với tổng số 1000 mẫu trong 10 lần thí nghiệm. Hạt đậu tương trưởng thành không bị sâu bệnh được khử trùng bề mặt trong 16 giờ bằng khí clo trong một buồng kín (Hình 4A).
Để có được mẫu cấy một lá mầm nửa hạt, các hạt đã khử trùng được ngâm trong nước vô trùng ở 23°C dưới bóng tối trong 16 -18 giờ. Các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình 4B- 4C). Có lắc nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
3.1.1. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22.
Mẫu lá mầm sau khi lây nhiễm với vi khuẩn được đồng nuôi cấy trên môi trường CCM rắn ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng /tối) trong 5 ngày (Hình 4D).
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy có chuyển xanh (Hình 4E) được đưa sang môi trường cảm ứng tái sinh chồi SIM lần 1trong 14 ngày có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn (Hình 4F). Cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn, duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. (Hình 4G). Các chồi chết là các chồi không chứa gen biến nạp.
26
Hình 4. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú:
(A): khử trùng hạt; (B): dung dịch huyền phù vi khuẩn; (C): lây nhiễm đậu
tương trong dung dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium; (D-E): đồng nuôi
cấy trên môi trường CCM; (F): Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 1; (G): Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 2.
A B C
D E
27
Bả500cộmError! Bookmark not defined.1 KEQ bmẫu tạo đa chồi hồi chuyển gengen (Fhù vi khuẩn; (C): lây nhiễm đậu tương trong dung dịch
có bổ sung chất Lần thí
nghiệm Số mẫu
Số lượng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi (%) CCM SIM1 Lần 1 100 90 61 67,78 Lần 2 100 91 65 71,42 Lần 3 100 92 62 67,39 Lần 4 100 95 72 75,79 Lần 5 100 97 66 68,04 Lần 6 100 84 58 69,04 Lần 7 100 72 51 70,83 Lần 8 100 88 59 67,05 Lần 9 100 86 54 62,79 Lần 10 100 91 55 60,44 Tổng cộng 1000 886 603 68,05
Qua kết quả bảng 3.1 cho thấy: sau 10 lần chuyển gen tổng số 1000 mẫu đậu tương DT22 được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1. Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được 886 mẫu sống sót. Với số mẫu tạo chồi là 603 sau 14 ngày tái sinh và chọn lọc lần thứ nhất trên môi trường SIM1 có chứa 10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi đạt 68,05%, chứng tỏ bước đầu biến nạp đã thành công.
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn lọc trên môi trường SIM2 có chứa 5mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng kéo dài chồi SEM. Chồi tái sinh có kích thước khoảng 4 cm (Hình 5A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để phát triển thành cây
28
Hình 5. Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A) và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trên môi trường RM (B)
Bết quả Error! Bookmark not defined.2 KSEQ Bả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễB)EM (A) và ra và ra khi chồi kéoương trong d thông qua vi
khu n A. Tumefaciens. Lần thí
nghiệm
Số lượng mẫu Tỷ lệ sống sau chọn lọc bằng kháng sinh (%) SIM2 SEM RM Lần 1 61 11 4 18,03 Lần 2 56 5 3 8,93 Lần 3 62 5 5 8,06 Lần 4 67 6 3 8,96 Lần 5 66 7 4 10,61 Lần 6 58 4 3 6,90 Lần 7 51 7 4 13,73 Lần 8 59 7 3 11,86 Lần 9 54 2 1 3,70 Lần 10 55 1 0 1,82 Tổng cộng 589 55 30 9,34 A B
29
Kết quả chọn lọc từ 589 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 55 chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 9,34%), số chồi đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ là 30 chồi (Bảng 3.2, Hình 5).
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho đến khi trưởng thành (Hình 6A). Kết quả biến nạp của 10 thí nghiệm đã thu được 12 cây đậu tương chuyển gen T0 sống sót sau khi chuyển ra trồng trong điều kiện nhà lưới (Hình 6B). Cây chuyển T0 tiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và PCR.
Bảng 3. 13 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi
khuẩn A. tumefaciens Lần thí
nghiệm
Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ trên môi trường RM Số cây sống sót sau khi ra đất Lần 1 4 2 Lần 2 3 1 Lần 3 5 2 Lần 4 3 1 Lần 5 4 1 Lần 6 3 2 Lần 7 4 2 Lần 8 3 1 Lần 9 1 0 Lần 10 0 0 Tổng cộng 30 12
30
Hình 6. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú: (A): Cây chuyển gen được trồng ra bầu đất cảm ứng trong phòng; (B): Cây chuy cảm ứng trong phòngông qua vi khuẩn A. tumefaci
Bvào gi Error! Bookmark not defined.4 KSEQ Bi chuy Bi Cây đu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. nạp gen CBF Lần thí nghiệm Số mẫu biến nạp (mẫu) Số cây sống sót sau khi ra đất Số cây sống sót sau khi phun kiểm tra basta
Hiệu suất biến nạp (%) Lần 1 90 2 1 1,11 Lần 2 91 1 0 0 Lần 3 92 2 2 2,17 Lần 4 95 1 1 1,10 Lần 5 97 1 0 0 Lần 6 84 2 0 0 Lần 7 72 2 1 1,39 Lần 8 88 1 0 0 Lần 9 86 0 0 0 Lần 10 91 0 0 0 Tổng cộng 886 12 5 0,56 A B
31 Qua kết quả bảng 3.4 ta thấy:
Kết quả chọn lọc bằng basta (10mg/l) ở 12 cây chuyển gen T0 thu được 5 cây chuyển gen kháng sau khi phun (tỷ lệ 0,56%).
Kết quả này cho thấy cây chuyển gen T0 đã mang gen kháng basta và có thể có gen chuyển CBF1 và cần kiểm tra bằng phương pháp PCR.
3.1.2. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm
Sau khi khử trùng hạt (Hình 4A), các lá mầm được tạo tổn thương. Chuyển các mẫu cấy nửa hạt vào đĩa petri có chứa dịch huyền phù vi khuẩn
Agrobacterium đã chuẩn bị sẵn lây nhiễm trong 30 phút (Hình 4B- 4C). Có lắc
nhẹ nhàng (50 -70 vòng/phút).
Mỗi mẫu nửa lá mầm sau khi lây nhiễm mẫu cấy được chia đặt đều trên giấy lọc vô trùng trên CCM rắn trong đĩa Petri (đường kính 90 mm x sâu 15 mm). Mẫu đồng nuôi cấy ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18 / 6h (sáng /tối) trong 5 ngày (Hình 7A).
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy có chuyển xanh (Hình 7B) được đưa vào (nghiêng 45 độ) trong môi trường cảm ứng tạí sinh chồi SIM lần 1 trong 14 ngày có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và được duy trì ở điều kiện 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối (Hình 7C).
Hai tuần sau, các mẫu cấy được cắt bỏ phần lớn lá mầm, thu các cụm chồi tạo thành chuyển sang môi trường tạo chồi lần thứ hai có bổ sung chất chọn lọc và kháng sinh diệt khuẩn (Hình 7D). Duy trì 14 ngày ở chế độ 230C và thời gian chiếu sáng 18/6h sáng/tối để chọn lọc chồi chuyển nạp gen. Các chồi chết là các chồi không chứa gen biến nạp.
32
Hình 7. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
Ghi chú:
(A)Mẫu đậu tương Cọc chùm đồng nuôi cấy trên môi trường CCM;
(B)Mẫu đậu tương Cọc chùm đồng nuôi cấy trên môi trường CCM sau
5 ngày;
(C)Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 1; (D)Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM lần 2;
33
Bần 2;n Error! Bookmark not defined.5 KSEQ bn gen trên môi trường SIM lần 1;uẩn A. tumefaciens.sang môiu tương Cọ tương thông qua vi
khu môi tumefaciens Lần thí
nghiệm Số mẫu
Số lượng mẫu Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi (%) CCM SIM1 Lần 1 100 90 61 67,78 Lần 2 100 81 62 76,54 Lần 3 100 92 59 64,13 Lần 4 100 88 69 78,41 Lần 5 100 85 64 75,29 Lần 6 100 89 58 65,17 Lần 7 100 72 49 68,06 Lần 8 100 91 63 69,23 Lần 9 100 68 54 79,41 Lần 10 100 75 52 69,33 Tổng cộng 1000 831 591 71,12
Qua kết quả bảng 3.5 ta thấy: sau 10 lần thí nghiệm chuyển gen tổng số 1000 mẫu đậu tương cọc chùm được lây nhiễm với vi khuẩn mang gen CBF1
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy thu được 831 mẫu sống sót. Với số mẫu tạo chồi là 591 sau 14 ngày tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen lần thứ nhất trên môi trường SIM1 có chứa 10mg/l PPT. Tỷ lệ mẫu tạo đa chồi ở đậu tương Cọc chùm đạt 71,12%, cao hơn ở DT22 (68,05%) chứng tỏ bước đầu biến nạp đã thành công.
Sau 14 ngày chọn lọc trên môi trường SIM1, mẫu cấy tiếp tục được chọn lọc trên môi trường SIM2 có chứa 5 mg/l PPT trong 14 ngày. Mẫu được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng kéo dài chồi SEM. Chồi tái sinh có kích
34
thước khoảng 4 cm (Hình 8A) được chuyển sang môi trường tạo rễ RM để phát triển thành cây hoàn chỉnh (Hình 8B).
Hình 8. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ
Ghi chú: (A) Hình ảnh cây Cọc chùm chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM;
(B) Cây Chuyu Cyển ra r Cyển gen tái sinh trên môi trường SEM;
Bảng 3. 26 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Lần thí nghiệm Số lượng mẫu Tỷ lệ sống sau chọn lọc
bằng kháng sinh (%) SIM SEM RM Lần 1 61 13 2 21,31 Lần 2 62 6 1 9,68 Lần 3 59 9 0 15,25 Lần 4 69 3 1 4,35 Lần 5 64 8 3 12,50 Lần 6 58 8 2 13,79 Lần 7 49 2 1 4,08 Lần 8 62 3 3 4,83 Lần 9 54 9 0 16,67 A B
35
Lần 10 52 6 0 11,54
Tổng cộng 590 67 13 11,35
Kết quả chọn lọc từ 590 mẫu trên môi trường SIM2 thu được tổng số 67 chồi tái sinh trên môi trường chọn lọc SEM (tỷ lệ 11,35%), số chồi đủ tiêu chuẩn chuyển sang môi trường tạo rễ là 13 chồi (Bảng 3.6, Hình 8).
Bcây đ Error! Bookmark not defined.7 KSEQ B trình chiếp tục được chọn lọc bằng thuốc trừ cỏ basta và PCR. CBF1 vào cây đậu tươm thông qua
vig cọc chùm thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Lần thí
nghiệm
Chồi sống sót sau chọn lọc tạo rễ trên môi trường RM
Số cây sống sót sau khi ra đất (cây) Lần 1 2 1 Lần 2 1 0 Lần 3 0 0 Lần 4 1 1 Lần 5 3 2 Lần 6 2 1 Lần 7 1 1 Lần 8 3 3 Lần 9 0 0 Lần 10 0 0 Tổng cộng 13 9
Cây chuyển gen được chuyển ra chậu đất và trồng trong nhà lưới cho đến khi