5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.3. Benzamidine ba càng chứa hợp phần α-aminoacid và phức chất của chúng
chúng
Năm 1996, L. Beyer và các cộng sự là những người đầu tiên công bố nghiên cứu về benzamidine ba càng chứa hợp phần α-amino acid, họ đã xác định được cấu trúc, độ dài liên kết, góc liên kết của 4 phối tử benzamidine ba
càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucinate [13]. Các phối tử này được tổng hợp từ phản ứng giữa benzamidoyl chloride với alkyl este của α-amino acid dưới sự hỗ trợ của triethylamine theo mô tả ở Hình 1.26.
Hình 1.26. Sơ đồ phản ứng điều chế các benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine
Hình 1.27. Cấu trúc các benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine [13]
Hình 1.27 trình bày cấu trúc của bốn phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine được L. Beyer xác định bằng nhiễu xạ đơn tinh thể.
Trong 4 cấu trúc ở Hình 1.27, các phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine có điểm chung là nguyên tử N1 không liên kết với H, nó ở dạng enamine.
Một số độ dài liên kết, góc liên kết của các phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine được trình bày ở Bảng 1.7.
Bảng 1.7. Một số độ dài liên kết, góc liên kết trong 4 phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần Methyl L-vanalinate và Methyl L-leucine [13]
Năm 2009, U. Abram và cộng sự công bố nghiên cứu về cấu trúc của phức chất của oxorhenium(V) với phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester [46]. Cấu trúc của phối tử này được đưa ra ở Hình 1.28.
Hình 1.28. Cấu trúc của phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester (HL(GlyOEt)) [46]
Phức chất của phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester với ion kim loại Re(V)[46] đã được nghiên cứu bằng nhiễu xạ đơn tinh thể (Hình 1.29). Nghiên cứu đã chỉ ra benzamidine chứa hợp phần glycine ethylester đóng vai trò phối tử benzamidine một càng thông qua nguyên tử cho S hoặc ba càng thông qua bộ nguyên tử cho (S,N,O) khi nhóm este bị thủy phân.
[ReOCl3(HL(GlyOEt))(PPh3)] [ReOCl(LGly)(PPh3)]
Hình 1.29. Cấu trúc phức chất của Re(V) với phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần glycine ethylester
Năm 1999, J.J. Criado và cộng sự tiến hành nghiên cứu về hoạt tính kháng nấm của phức chất benzamidine ba càng chứa dẫn xuất vaniline và leucine với các ion kim loại Ni(II), Cu(II), Pt(II) trên dòng nấm Botrytis cinerea (gây bệnh thối xám), nấm Colletotrichum fragariae (gây bệnh thán thư), nấm Rhizoctonia solani (gây bệnh thối rễ), nấm Pleospora betae (gây bệnh thối lá). Kết quả đạt được cho thấy cả phối tử và phức chất của chúng đều có hoạt tính cao [16], [43].
Từ tổng quan đã nêu ở trên, có thể thấy hướng nghiên cứu về hóa học phối trí của (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α- amino acid là một hướng nghiên cứu mới với phạm vi nghiên cứu rộng và tiềm năng ứng dụng lớn. Tuy nhiên, hiện vẫn còn đang ở thời kỳ sơ khai. Việc tổng hợp, khảo sát phối tử và phức chất còn thiếu tính hệ thống. Cụ thể, chỉ có một số ít phối tử (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α- amino acid và phức chất của chúng với Ni(II), Cu(II), Pt(II), Re(V) được khảo sát nhưng chỉ có vài cấu trúc được làm sáng tỏ bằng các phương pháp hiện đại như nhiễu xạ tia X trên đơn tinh thể. Hoạt tính sinh học tiềm năng của lớp hợp chất này chưa được quan tâm đúng mức. Hiện chỉ có 6 phức chất của Ni(II),
Cu(II), Pt(II) được được khảo sát hoạt tính kháng nấm, còn các hoạt tính khác như kháng khuẩn, kháng virut, kháng tế bào ung thư… chưa được thực hiện. Những nghiên cứu nhỏ lẻ trên một vài phức chất gây hạn chế việc làm rõ mối liên hệ giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc.
Do vậy yêu cầu đặt ra là cần nghiên cứu một cách có hệ thống cấu trúc các phức chất của (N,N-dialkylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α-amino acid với các ion kim loại chuyển tiếp bằng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể, tiếp theo là khảo sát các hoạt tính sinh học như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut, kháng tế bào ung thư, qua đó làm sáng tỏ mối liên hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học. Với những bài toán đặt ra ở trên, hướng đề tài “Tổng hợp, nghiên cứu cấu trúc và đánh giá hoạt tính sinh học một số phức chất của ion kim loại Co, Ni với phối tử benzamidine ba càng chứa hợp phần alanine” là cần thiết, có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn.
Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, THỰC NGHIỆM 2.1. Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Phân tích hàm lượng ion kim loại bằng chuẩn độ complexon III
Hàm lượng ion M2+ (Co2+, Ni2+) được xác định dựa trên phản ứng tạo phức bền của ion kim loại với EDTA tại pH = 8, chất chỉ thị là murexit 1% trong NaCl.
M2+ + H2Y2- → MY2- + 2H+ MH4Ind+ + H2Y2- → MY2- + H4Ind- (vàng nhạt) (tím)
Cách tiến hành: Lấy chính xác V1 (ml) dung dịch mẫu vào bình nón, thêm một ít chỉ thị murexit, dùng dung dịch NH3 để điều chỉnh pH ≈ 8 (thêm vài giọt dung dịch NH3 cho tới khi trong bình có màu vàng thoáng đục). Chuẩn độ M2+ bằng dung dịch EDTA đã biết nồng độ cho tới khi dung dịch chuyển sang màu tím. Lặp lại thí nghiệm ba lần và lấy kết quả trung bình V2
(ml) lượng EDTA đã chuẩn độ.
Hàm lượng ion M2+ được tính theo công thức sau:
%M = V2. CEDTA V1 . 50 103 . MM. 1 m . 100% %M = 5.V2 V1 . CEDTA. MM m trong đó:
V1 : thể tích dung dịch M2+ đem chuẩn độ (ml)
V2 : thể tích dung dịch EDTA đã tiêu tốn (ml)
CEDTA : nồng độ mol của dung dịch EDTA đã dùng (mol/l)
MM : khối lượng mol của kim loại M (g/mol)
2.1.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phương pháp phổ hồng ngoại IR là một trong những phương pháp vật lý hiệu quả để nghiên cứu cấu tạo của các phân tử hữu cơ, bởi nó cung cấp nhanh thông tin về cấu trúc phân tử, không đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp.
Cơ sở của phương pháp dựa trên hiện tượng các hợp chất hoá học hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại (số sóng cỡ 4000 - 100 cm-1), cả chuyển động quay và chuyển động dao động bị kích thích làm xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Kết quả được biễu diễn bằng đồ thị hàm số năng lượng sóng điện từ đi qua phụ thuộc vào bước sóng. Trục hoành biểu diễn số sóng (cm-1), trục tung là hệ số hấp thụ sóng điện từ (độ truyền qua) có đơn vị là %. Độ truyền qua 100% nghĩa là mẫu thử không hấp thụ bức xạ, còn độ truyền qua 0% tức toàn bộ bức xạ đã bị hấp thụ, nên dải hấp thụ trong phổ IR là phần đi xuống [3].
Theo qui tắc chọn lọc quang phổ hấp thụ, chỉ những bức xạ làm thay đổi momen lưỡng cực của phân tử mới hoạt động trên phổ IR. Theo điều kiện này thì các phân tử đối xứng về mặt phân bố điện tích như O2, N2, H2… sẽ không xuất hiện phổ hấp thụ hồng ngoại, nên không cần đuổi hết không khí ra khỏi máy quang phổ kế hồng ngoại.
Thực nghiệm cho thấy, các nhóm chức, nhóm nguyên tử và liên kết trong phân tử có các đám phổ hấp thụ hồng ngoại đặc trưng khác nhau. Nói cách khác, các hợp chất chứa cùng một số nhóm nguyên tử giống nhau đều thể hiện những dải hấp thụ với tần số gần như giống nhau, từ đó người ta thống kê lại các tần số dao động này để làm tài liệu tra cứu. Bằng cách so sánh phổ thực nghiệm với phổ chuẩn của một hợp chất hay bảng thống kê tần số dao động của các nhóm nguyên tử, ta có thể nhận biết sự có mặt hay không của một nhóm chức nào đó ở chất nghiên cứu [3].
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định như không cho biết phân tử lượng (trừ trường hợp đặc biệt) cũng như thông tin về các vị trí tương đối của các nhóm chức khác nhau trên một phân tử. Chỉ riêng phổ hồng ngoại thì đôi khi chưa thể biết đó là chất nguyên chất hay chất hỗn hợp vì có trường hợp 2 chất có phổ hồng ngoại giống nhau.
2.1.3. Phương pháp phổ khối lượng (ESI-MS)
Phương pháp phổ khối lượng có ý nghĩa rất quan trọng đối với việc nghiên cứu, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ, vì thế phương pháp này thường được sử dụng trong các nghiên cứu về phức chất. Dựa trên các số khối thu được trên phổ, có thể xây dựng cấu trúc phân tử phức chất hoặc chứng minh sự đúng đắn của công thức cấu tạo dự kiến.
Nguyên tắc chung của phương pháp phổ khối lượng là phá vỡ phân tử trung hòa thành ion phân tử và các mảnh ion dương có số khối m/z (m là khối lượng, z là điện tích ion). Sau đó phân tách và ghi nhận các ion này theo số khối sẽ thu được phổ khối lượng của mẫu phân tích. Trên đồ thị phổ khối, trục tung là cường độ chùm ion dương đi vào detector, trục hoành là tỷ số m/z.
Có 3 yếu tố chi phối quá trình ion hóa phân tử, bao gồm: cấu tạo của phân tử, phương pháp bắn phá và năng lượng bắn phá. Có thể thực hiện quá trình bắn phá phân tử bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp va chạm electron (EI: electron ionization), phương pháp ion hóa phun điện tử (ESI: electrospray ionization), phương pháp ion hóa hóa học (CI: chemical ionization)… [6]
Phương pháp ESI là phương pháp ion hóa phổ biến dùng cho nghiên cứu phức chất và phù hợp với các hợp chất kém bay hơi. Phương pháp này có đặc điểm là quá trình ion hóa xảy ra êm dịu. Trong kỹ thuật ESI, các ion dương tạo thành có thể gắn thêm một proton và các ion âm tạo thành có thể mất bớt một proton, do vậy ion dương [M + H]+ có khối lượng lớn hơn khối lượng
phân tử một đơn vị và ion âm [M – H]− có khối lượng nhỏ hơn khối lượng phân tử một đơn vị. Trong nhiều trường hợp, các ion dương được tạo thành do kết hợp với các cation có sẵn trong dung dịch như Na+, K+, NH4+…tạo nên các ion dương [M + Na]+, [M + K]+, [M + NH4]+…
Dựa theo phổ của các mẫu chuẩn có thể xác định sự có mặt của các nguyên tố, phân tử có trong mẫu phân tích. Dựa theo cường độ vạch phổ của mẫu phân tích chứa nguyên tố hay chất cần phân tích, so sánh với cường độ vạch phổ của mẫu chuẩn có thể xác định được nồng độ của chúng.
2.1.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một trong những phương pháp hiện đại nhất nhằm xác định cấu trúc của các hợp chất hóa học. So với phương pháp phổ hồng ngoại, phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân cung cấp những thông tin chính xác và cụ thể hơn.
Nhiều hạt nhân có spin - gọi là spin hạt nhân khác không. Theo cơ học lượng tử, khi đặt các hạt nhân này trong từ trường sẽ có sự tách các trạng thái năng lượng. Khi không có năng lượng kích thích, hạt nhân ở trạng thái cơ bản - có năng lượng thấp nhất. Khi được kích thích bởi sóng điện từ có tần số υ
(cỡ tần số sóng radio), hạt nhân chuyển lên mức năng lượng cao nhờ hấp thụ năng lượng. Sự hấp thụ năng lượng được ghi lại như một vạch phổ được gọi là một tín hiệu cộng hưởng. Mỗi giá trị υ đặc trưng cho mỗi loại hạt nhân và môi trường từ (lớp vỏ electron, hạt nhân lân cận…) xung quanh nó. Dựa trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể thu được các thông tin:
- Độ dịch chuyển hóa học đặc trưng cho môi trường xung quanh hạt nhân từ.
- Hằng số tương tác spin - spin.
Bằng cách xác định sự dịch chuyển tín hiệu cộng hưởng của nhóm chức chứa proton trước và sau phản ứng có thể chứng minh nhóm chức đó đã tham gia liên kết hay không. Để chứng minh quá trình tạo phức xảy ra cũng như việc xác định cấu trúc của phức chất trước hết phải qui kết chính xác các pic trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân, đồng thời có sự so sánh rõ ràng tín hiệu phổ của phức chất và phối tử tự do.
2.2. Dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Dụng cụ
Bình cầu hai cổ (50 ml, 500 ml, 750 ml), bình cầu một cổ 50 ml, phễu nhỏ giọt (100 ml), công tơ hút nhựa, nút nhám các loại, nhiệt kế 150 oC, sinh hàn, bẫy dầu, đũa thủy tinh, máy khuấy từ gia nhiệt, con khuấy từ, cân phân tích, phễu lọc thủy tinh đáy xốp, cốc chịu nhiệt (500 ml), máy lọc hút chân không, bình hút ẩm, bếp điện, hệ thống cất quay làm khô dung môi, tủ sấy, tủ hốt.
2.2.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong tổng hợp:
Hóa chất Xuất xứ Độ tinh khiết
C6H5CO-Cl Sigma-Aldrich 99% Co(OAc)2.4H2O Sigma-Aldrich 99% Ni(OAc)2.4H2O Sigma-Aldrich 99% (C2H5)2NH Sigma-Aldrich 99% (C2H5)3N Sigma-Aldrich 99% SOCl2 Sigma-Aldrich 97% KSCN Sigma-Aldrich 99%
2.2.3. Chuẩn bị hóa chất
- KSCNđược sấy khô trong tủ sấy ở 80 oC cho đến khi khối lượng không đổi.
- Các dung môi dùng cho phản ứng được chưng cất lại, sau đó làm khô trong hệ thống làm khô dung môi. Acetone và carbon tetrachloride được làm khô bằng P2O5. Triethylamine và THF được làm khô bằng Na, có sử dụng chất chỉ thị benzophenol (khi đã khan nước, chỉ thị từ không màu sẽ chuyển sang màu xanh).
2.3. Tổng hợp phối tử HAlaEt
Quá trình tổng hợp phối tử (N,N-diethylthiourea)benzamidine ba càng chứa hợp phần α-alanine được tiến hành qua 4 giai đoạn:
2.3.1. Giai đoạn 1: Tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea
Quá trình tổng hợp N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea được thực hiện theo quy trình phản ứng “một bước” (one pot) do I. B. Douglass và F. B. Dains đưa ra năm 1934 [20].
Cho 58 ml (~ 0,5 mol) benzoyl chloride (dbenzoyl chloride = 1,21 g/ml) vào phễu nhỏ giọt, cho thêm 20 ml acetone khô, rồi nhỏ từ từ vào bình cầu hai cổ chứa 53 g KSCN sấy khô (~ 0,55 mol) đã hòa tan trong 50 ml acetone khan. Đun nóng và khuấy đều hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50 oC trong 2 giờ. Để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng, sau đó tiếp tục nhỏ từ từ 40 ml diethylamine (C2H5)2NH (~ 0,55 mol) vào bình phản ứng, khuấy đều hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và tiếp tục khuấy ở nhiệt độ 50 oC trong 2 giờ. Để nguội bình phản ứng về nhiệt độ phòng rồi rót hỗn hợp phản ứng vào cốc chứa 800 ml nước cất, khuấy nhẹ bằng đũa thủy tinh trong 10 phút để N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea kết tủa hoàn toàn. Lọc hút chất rắn trên phễu thủy tinh đáy xốp, rồi làm khô sản phẩm. Kết quả thu được 90,5 g
2.3.2. Giai đoạn 2: Tổng hợp phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato)nickel(II) benzoylthioureato)nickel(II)
Hòa tan 70 g N,N-diethyl-N’-benzoylthiourea (0,3 mol) bằng ethanol nóng trong cốc chịu nhiệt 500 ml, thêm dần dung dịch chứa 37,33 g muối Ni(OAc)2.4H2O (0,15 mol) trong methanol nóng vào dung dịch trên. Vừa khuấy vừa đun nóng nhẹ trong vòng 15 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng, thấy xuất hiện kết tủa màu đỏ tím. Tiến hành lọc và sấy khô kết tủa, thu được 75,4 g phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato)nickel(II). Hiệu suất đạt 95%.
2.3.3. Giai đoạn 3: Tổng hợp N,N-diethylbenzimidoyl chloride
Lắp hệ thống phản ứng gồm bình cầu hai cổ 750 ml, phễu nhỏ giọt 100 ml, khuấy từ, bẫy dầu, bếp từ gia nhiệt.
Cho 26,4 gam phức chất bis(N,N-diethyl-N’-benzoylthioureato)nickel(II) (0,05 mol) vào bình cầu 2 cổ chứa 100 ml CCl4 khan, tiếp tục nhỏ từ từ 7,5 ml SOCl2 khan vào bình phản ứng. Tiến hành khuấy và đun nóng ở nhiệt độ 50
oC trong 2 giờ. Sau đó nhanh chóng lọc nóng hỗn hợp phản ứng trên phễu lọc khô, thu lấy dịch lọc. Dịch lọc thu được trong suốt và có màu vàng. Sử dụng máy cất quay chân không để loại bỏ CCl4 ở dịch lọc, sau đó để yên cho sản phẩm tự kết tinh. Kết quả thu được 12,23 g tinh thể N,N- (diethylcarbamothioyl)benzimidoyl chloride màu vàng nhạt. Bảo quản sản phẩm trong lọ kín. Hiệu suất đạt 52%.
2.3.4. Giai đoạn 4: Tổng hợp phối tử (N,N-diethyl)benzamidine ba càng chứa hợp phần L-alanine methyl ester (HAlaEt) chứa hợp phần L-alanine methyl ester (HAlaEt)