Sẽ được tiến hành theo 2 bước:
-Bước 1: Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm -Bước 2: Nuôi cấy và định danh
Nhuộm soi, soi tươi sơ bộ mẫu bệnh phẩm[15]:
Quan sát bằng kính hiển vi sẽ cho phép người thực hiện sẽ nhìn thấy hình dạng, khả năng bắt màu của vi khuẩn. Việc soi tươi tiêu bản để phát hiện khả năng di chuyển, sự có mặt của nấm. Nhuộm tiêu bản để phát hiện hình thái, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn. Thông qua kết quả có thể định hướng cho việc nuôi cấy.
Soi tươi: Nhỏ 1-2 giọt NaCl 0.9% vô khuẩn lên lam kính, dùng que cấy hoặc tăm bông vô trùng hòa đều với giọt NaCl 0.9% trên lam kính. Đặt phiến kính lên giọt canh khuẩn nhẹ nhàng tránh tạo bọt khí. Soi dưới vật kính X10, hoặc X40.
25
Nhuộm soi: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram
Làm tiêu bản: Dùng que cấy lấy bệnh phết dàn mỏng lên phiến kính theo đường xoắn ốc đường kính 1cm, để tự khô hoặc cho vào tủ ấm. Sau đó tiến hành cố định trên ngọn lửa đèn cồn.
Tiến hành nhuộm:
-Nhỏ dung dịch thuốc tím Gentian lên tiêu bản, chờ trong 1 phút, rửa vòi nước đang chảy.
-Nhỏ tiếp dung dịch Lugol lên tiêu bản, đợi 30 giây, rửa vòi nước đang chảy. -Nhỏ cồn tuyệt đối lên phiến kính, khi thấy màu tím vừa phai hết, rửa nước ngay.
-Nhỏ dung dịch Fucsin lên tiêu bản, đợi 1 phút rửa vòi nước đang chảy. - Đợi tiêu bản khô, soi dưới vật kính dầu X100.
Đọc kết quả: Vi khuẩn có bắt màu tím là Gram dương. Vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram âm.
Nuôi cấy và định danh:
Bệnh phẩm sau khi được lấy về, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà ta tiến hành nuôi cấy trên môi trường thích hợp.
Bảng 3.1.Môi trường nuôi cấy cho từng loại bệnh phẩm
Bệnh phẩm Mủ Đờm Phân Dịch tỵ hầu Máu Nước tiểu
Môi trường Máu+
1/2 Uti Máu+ Soco+Mác SS ½máu+ ½ Soco Máu+ ½Uti Máu+ ½Uti
26
Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm:
Đối với bệnh phẩm là mủ, đờm, dịch tỵ hầu, phân:
18-24h
Đối với bệnh phẩm nước tiểu:
18-24h
Đánh dấu thông tin mặt sau hộp thạch và mẫu bệnh phẩm sao cho trùng khớp nhau
Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, ngón cái và ngón giữa tay trái mở nắp đĩa môi trường
Nhúng que cấy vào bệnh phẩm, cấy ria trên bề mặt môi trường theo kĩ thuật cấy 3 vùng
Đóng nắp đĩa peptri, nuôi trong tủ CO2,37◦C(DTH), bệnh phẩm khác nuôi trong tủ 36◦C
Đọc kết quả
Đánh dấu thông tin mặt sau hộp thạch và mẫu bệnh phẩm sao cho trùng khớp nhau
Sử dụng ăng cấy 1µl, nhúng vào bệnh phẩm, cấy ria trên bề mặt môi trường theo kĩ thuật cấy 3 vùng
Nuôi trong tủ ấm 36◦C
27
Định danh vi khuẩn:
Vi khuẩn sau khi mọc khuẩn lạc sẽ được mang đi định danh, phương pháp thông thường được sử dụng để xác định là dựa vào tính chất hóa học của vi khuẩn đó. Ngoài ra, hiện nay người ta đã sản suất ra các bộ xác định đồng thời các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn như API 20E (áp dụng vi khuẩn họ đường ruột, trực khuẩn Gram âm) hoặc 20NE (áp dụng trực khuẩn Gram dương), bộ đường này sẽ xác định được 20 tính chất của vi khuẩn.
Phương pháp thông thường là sẽ dựa vào một số tính chất như sau để xác định vi khuẩn.
Chuyển hóa đường:
Sử dụng môi trường KIA(Kligler Iron Agar): là môi trường tổng hợp gồm có hai loại đường là glucose và lactose, trong đó tỉ lệ giữa glucose và lactose là 1/10 và chất chỉ thị pH phenol đỏ. Nuôi cấy vi khuân và môi trường để ở nhiệt độ 37◦C trong 24h nếu vi khuẩn có màu đỏ sang màu vàng ở phần chân ống thạch (môi trường KIA đổ thạch nghiêng) thì môi trường có khả năng lên men đường glucose mà không lên men đường lactose. Nếu vi khuẩn có khẻ năng lên men đường lactose thì toàn bộ môi trường chuyển sang màu vàng[16].
Sử dụng môi trường Manitol: Là môi trường có chứa manit. Nuôi cấy vi khuẩn và môi trường để ở nhiệt độ 37◦C trong 24h nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng manit thì môi trường sẽ chuyển từ màu đỏ đậm sang màu vàng. Môi trường có màu đỏ đậm thạch bằng nên khi cấy dùng que cấy thẳng chọc vào giữa ống[16].
Các tính chất khác trong quá trình lên men đường:
Phản ứng Methyl Red (MR): Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh ra các axit(lactic, acetic,....) từ glucose qua con đường lên men nhất là các vi khuẩn đường ruột. Chúng sản sinh ra đủ một lượng axit để môi trường nuôi cấy luôn giữ pH ≤ 4,4. Sử dụng các môi trường lỏng như Clack-lubs để nuôi cấy[16].
Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cấy vào vi khuẩn. Ủ trong tủ ấm, sau 24-48h, nhỏ 2 - 3 giọt MR là ta có thể phát hiện ra chúng.
Đoc kết quả:
28
Phản ứng âm tính: môi trường chuyển sang màu vàng (pH=6).
Phản ứng Indol: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường nước pepton. Ủ trong tủ ấm. Sau 24h, nhỏ từ 0,2 ml đến 0,3 ml dung dịch thuốc thử Kovac’s vào môi trường, lắc nhẹ[17].
Đọc kết quả:
Phản ứng dương tính (sinh indol): xuất hiện vòng màu đỏ phía trên môi trường. Phản ứng âm tính (không sinh indol): không xuất hiện vòng màu đỏ.
Phản ứng Voges-Proskauer(VP): Một số vi khuẩn trong quá trình lên men đường có khả năng tạo ra chất trung gian là acetone. Có thể phát hiện chất này dựa trên sự biến đổi của acetone thành diacetone thành một phức chất màu đỏ dưới sự xúc tác của anpha-napthol và creatin, để phát hiện khả năng này ta nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường Clack - lubs [24].
Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường. Ủ trong tủ ấm, sau 24-48h thì nhỏ dung dịch thử VP.
Đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu đỏ. Phản ứng âm tính: môi trường có màu vàng nhạt.
Khả năng sử dụng Citrat: Môi trường Xitrat Simmons là môi trường thạch nghiêng có màu xanh lá cây. Môi trường có chứa Natri citrat là một loại muối của axit citric, là phân tử chứa một amion cũng là một nguồn carbon duy nhất và môi trường còn có (NH2)H2PO4 chứa nguồn nitro duy nhất[16].
Cách tiến hành:
Sử dụng que cấy, lấy khuẩn lạc của vi khuẩn cấy vào môi trường. Đem đi ủ trong tủ ấm, sau 18-24h thì đọc kết quả.
Đọc kết quả:Nếu vi khuẩn có khả năng phân giải natri citrate sẽ làm biến đổi màu môi trường từ xanh lá cây sang xanh dương thẫm.
Khả năng sinh H2S: Một số là vi khuẩn có khả năng giải phóng sulfua từ các axit amin hoặc hợp chất khác chứa lưu huỳnh ở dạng H2S[16].
29
Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường manitol hoặc môi trường SIM.
Đọc kết quả:
Đối với môi trường manitol: nếu vi khuẩn sử dụng đường manitol thì môi trường có màu vàng.
Khả năng di động của vi khuẩn bằng môi trường lỏng: Có một số loài vi khuẩn có lông, nên chúng có thể phát hiện bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường thạch mềm (thạch bằng có màu trắng)[16].
Cách tiến hành:
Dùng que cấy chích sâu lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng. Ủ trong tủ ấm.
Đọc kết quả sau 24h:
Phản ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu và vi khuẩn mọc lan quanh đường cấy như rễ cây.
Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu.
Khả năng phân giải ure:
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy vào môi trường thạch urê.Ủ trong tủ ấm[16].
Đọc kết quả sau 24h:
Phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng. Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu.
Thử nghiệm Oxydase:
Các vi khuẩn hiếu khí luôn có oxydase, để phát hiện được tính chất này ta nhỏ một giọt dung dịch dimetylparaphenylendiamin lên một miếng giấy lọc rồi lấy một ít khuẩn lạc của vi khuẩn để lên miếng giấy ẩm[16].
Đọc kết quả sau 10s đến 30s.
Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có màu xanh tím là dương tính (+). Phản ứng âm tính: Vi khuẩn không thay đổi màu sắc là âm tính (-).
30
Xác định các vi khuẩn Gram dương (Oxydase âm) bằng dùng hệ thống API 20E:
Api 20E là một hệ thống chuẩn được sử dụng để định các trục khuẩn Gram âm, có test Oxydase âm sử dụng thanh bao gồ 21 test tiểu sinh hóa và một số cơ sở dữ liệu.
Nguyên tắc:
Thanh Api 20E gồm có 20 giếng nhỏ chứa các môi trường đông khô.
Các test được gây chủng bằng huyền dịch vi khuẩn. Trong khi ủ, quá trình thay đổi chất làm thay đổi màu theo hướng tự phát hoặc là biểu hiện ra khi thêm các thuốc thử.
Phản ứng được dựa vào bảng có sẵn và kết quả định danh sẽ được dựa vào một phần mềm định danh đã có sẵn.
Quy trình thực hiện:
Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều. Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm. Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm.
Đọc kết quả sau 18h đến 24h
Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử. Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử:
TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuất hiện thì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính.
IND: Nhỏ một giọt thuốc thử JAMES. Đợi 2 min, xuất hiện một vòng màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính.
VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 phút đến 12 phút là phản ứng âm tính.
31
Hình 3.1.API 20E sử dụng trong chuẩn đoán, định danh vi khuẩn Gram âm oxydase âm
Xác định các vi khuẩn Gram âm (Oxydase dương) bằng dùng hệ thống API 20NE
Api 20NE là một hệ thống chuẩn được sử dụng để định các trục khuẩn Gram âm, có test Oxydase dương sử dụng thanh bao gồ 20 test tiểu sinh hóa và một số cơ sở dữ liệu.
Nguyên tắc:
Thanh Api 20NE gồm có 20 giếng nhỏ có chất nền (8 test thông thường và 12 test đồng hóa), khi cho canh khuẩn vào và ủ ở 300 C trong 18-24h, sự trao đổi chất trong quá trình ủ sẽ trực tiếp làm đổi màu môi trường, hay khi cho thêm hóa chất thích hợp đối với các test thông thường hoặc làm đục môi trường đối với các test đồng hóa mà mắt thường nhìn thấy được. Kết quả của các phản ứng này được đọc bằng phần mềm hoặc sách hướng dẫn của hãng Bio Merieux. Từ các kết quả đó ta có các xác xuất của vi khuẩn nào đó (theo nghiên cứu của nhà sản xuất đã được công nhận).
Quy trình thực hiện:
Sau khi test oxydase dương tính thì ghi kết lại kết quả và sẽ điền vào vị trí 21 của kết quả làm giá đường. Chỉ làm giá đường Api 20NE với các trực khuẩn Gram âm có test Oxydase dương tính (không phải họ đường ruột).
Chuẩn bị cho thanh Api 20NE:
Lấy 1 hộp ủ nhựa (khay và nắp cung cấp kèm trong hộp Api) và cho khoảng 5ml nước cất hoặc nước sinh hoạt vào đầy các lỗ trên khay. Ghi lại các thông tin của mẫu cần chạy lên khay (số bệnh phẩm, ngày giờ thực hiện…). Lấy thanh Api 20NE ra khỏi vỏ. Đặt thanh Api 20NE vào trong hộp ủ.
32
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn:
Mở nắp ống nước muối sinh lý 5ml đã hấp vô trùng (hoặc ống API Supspension medium 2ml). Dùng que cấy lấy 2-3 khuẩn lạc đã nuôi cấy thuần nhất qua đêm (18h -24h) nghiềnvào trong ống nước muối để tạo huyền dịch có độ đục 0,5 Mac Faland (so với độ đục chuẩn hoặc đo bằng máy).
Tiến hành ủ:
Dùng pipet vô khuẩn hút canh khuẩn vừa pha nhỏ vào các giếng: nhỏ vừa đủ đến miệng giếng từ giếng NO3 đến PNPG. Mở nắp ống Api AUX medium 7ml, cho khoảng 10 giọt (200 µl) canh khuẩn vào trộn đều và nhỏ vào các giếng từ GLU tới PAC, chú ý phải nhỏ bằng mặt giếng hoặc có vồng (nhỏ quá ít hoặc bị tràn có thể làm sai kết quả). Nhỏ paraphin vào đầy các giếng có gạch chân là GLU, ADH, URE. Đậy nắp khay của hộp ủ. Để vào tủ ấm 300 C (29 0C ± 20 C) ủ trong vòng 24h.
Đọc kết quả sau 18h đến 24h:
Sau giai đoạn ủ ta lấy giá đường ra và đọc kết quả âm tính hay dương tính của các giếng theo bảng phụ lục.
Giếng NO3 phải nhỏ thêm 1 giọt NIT1 và 1 giọt NIT2 và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính có màu đỏ.
Giếng TRP phải nhỏ thêm 1 giọt JAMES và đợi 5 phút trước khi đọc kết quả, kết quả dương tính khi giếng chuyển sang màu hồng.
Các test đồng hóa (các giếng từ GLU tới PAC) dương tính khi bề mặt bị đục.
Hình 3.2.API 20NE sử dụng trong chuẩn đoán, định danh họ vi khuẩn
33
Xác định các vi khuẩn Gram âm bằng hệ thống tự động Vitek II
Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh.
Nguyên tắc:
Định danh vi khuẩn Gram âm gây bệnh dựa vào phương pháp đo màu để nhận biết các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn thông qua sự đổi màu các giếng trong môi trường có sẵn trong card.
Quy trình thực hiện:
Chuẩn bị card xét nghiệm định danh. Chủng vi khuẩn cần thử nghiệm phải thuần nhất trong điều kiện tối ưu và đang ở giai đoạn phát triển mạnh (nuôi cấy sau 18-24 giờ).Chuẩn bị huyền dịch trực tiếp từ khuẩn lạc: Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ 3-5 khuẩn lạc có hình thái giống nhau nghiền đều vào ống nghiệm vô trùng 12mm x 75mm đã có 3ml nước muối được hút bằng Dispenser, lắc đều trên máy lắc để có huyền dịch đồng nhất đo độ đục đạt khoảng 0,55-0,65 McFarland (đo bằng DENSICHEK).Huyền dịchvi khuẩn sau khi pha, phải được sử dụng ngay trong vòng 15 phút.
Chuẩn bị card xét nghiệm làm kháng sinh đồ. Sau đó, dùng pipette 280 μl (đối với card gram dương), dùng pipette 145μl (đối với card gram âm) và dùng pipette phù hợp hút huyền dịch vi khuẩn vào ống nghiệm đã có chứa 3ml nước muối (saline0,45%).
Tiến hành
Đặt ống nghiệm và card lên cassette. Tiếp theo, đưa cassette vào buông hút. Khi có 1 tiếng tín hiệu phát ra chuyển các cassette đã được hút mẫu qua loading station.
Đọc kết quả sau 18h đến 24h:
Thay vì phải đọc bằng mắt thường xem sự phát triển của vi khuẩn có hay không, hệ thống tự động sẽ đo độ đục của canh khuẩn hoặc đo tín hiệu huỳnh quang biến đổi có trong môi trường nuôi cấy để xác định vi khuẩn. Hơn nữa, hệ thống tự động có thể kết nối với phần mềm quản lý của phòng xét nghiệm để chuyển trực tiếp kết quả từ hệ thống tự động sang hệ thống phần mềm quản lý.
34