4.1.1. Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu
Hàm lượng chất khô của bã ổi đào là 32,637% cho thấy bã ổi đào có hàm lượng nước khá cao chiếm 67,363% trọng lượng khô. Hàm lượng ẩm cao là một bất lợi trong quá trình bảo quản mẫu. Vì vậy, để thuận tiện trong quá trình bảo quản và chiết tách thì ta phải tiến hành làm khô sao cho hàm lượng nước trong bã ổi đào xuống đến ẩm độ khoảng 10%. Hơn nữa làm khô giúp thuận tiện cho quá trình xay nhỏ, giảm kích thước, tạo độ đồng đều cho mẫu giúp quá trình tách chiết đem lại hiệu quả cao hơn.
4.1.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol tổng của bã quả ổi đào 38,465mg GAE/g DW cao hơn so với hàm lượng polyphenol thu được từ vỏ thân quao nước khi sử dụng dung môi là hexan, thời gian chiết tách là 3 giờ, nhiệt độ chiết tách là
30oC với tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 1/10 theo nghiên cứu của Phạm Ngọc
Khôi (2017) với hàm lượng polyphenol là 36,79 mgGAE/g DW. Một số tác giả đã công bố hàm lượng polyphenol trong một số loại thực vật. Kết quả nghiên cứu của Marja và cộng sự (1999) khi nghiên cứu hàm lượng polyphenol của 92 loại thực vật ăn được và không ăn được đã báo cáo rằng hàm lượng polyphenol của chúng dao động khá rộng trong khoảng từ 0,2 đến 155,3 mg GAE/g DW. Theo nhóm tác giả này những loại thực vật có hàm lượng polyphenol lớn hơn 20 mg GAE/g DW thì có hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hàm lượng polyphenol của bã ổi đào còn lại là tương đối cao chúng có thể được dùng để ứng dụng trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm. Tuy nhiên, để khẳng định khả năng chống oxi hóa cần tiến hành các phân tích in vitro để khẳng định khả năng chống oxi hóa của bã ổi đào.
4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào từ bã ổi đào
4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol hàm lượng polyphenol
Nhìn vào bảng 4.1 cho thấy hàm lượng polyphenol thu được thấp nhất là 36.87 mg GAE/g DW khi sử dụng dung môi là meOH, cao thứ 2 là nước với hàm lượng polyphenol là 37,19 mg GAE/g DW và cao nhất là EtOH với hàm lượng polyphenol là 37,23 mg GAE/g DW. Ta thấy ở dung môi là nước và EtOH cho hàm lượng polyphenol không có sự sai khác về giá trị trung bình. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn nước là dung môi để tránh ô nhiễm, giảm công đoạn thu hồi dung môi và tiết kiệm được chi phí tách chiết.
Bởi vì lựa chọn dung môi nước cho nên không có nồng độ dung môi.
Bảng 4.1. Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi khác nhau
Dung môi Hàm lượng polyphenol
(mg GAE/ g DW)
MeOH 36,87b
Nước 37,19a
EtOH 37,23a
4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol polyphenol
Tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol thu được. Nếu lượng dung môi quá ít thì không đủ để hòa tan, chiết rút các cấu tử ra bên ngoài môi trường, chỉ đủ làm ướt nguyên liệu. Nếu dùng lượng dung môi lớn thì gây lãng phí, tốn kém dung môi, chi phí cao. Thí nghiệm tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol thu được và tìm ra tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tốt nhất cho quá trình chiết, kết quả được trình bảy ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol
Công thức Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
(ml/g) Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW) CT1 5/1 36,22b CT2 10/1 37,06a CT3 15/1 35,93b CT4 20/1 35,49c
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05
Qua bảng trên ta thấy được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu có ảnh hưởng tới hàm lượng polyphenol được chiết từ bã ổi đào. Ở tỷ lệ 10/1, hàm lượng polyphenol đạt cao nhất là 37,06 mg GAE/g DW, hàm lượng polyphenol cao thứ 2 là 36,22 mg GAE/g DW ở tỷ lệ 5/1 và giảm dần ở 2 tỷ lệ 15/1 và 20/1 với hàm lượng polyphenol lần lượt là 35,93 mg GAE/g DW và 35.8 mg GAE/g DW. Đạt hàm lượng polyphenol cao nhất 37,06 mg GAE/g DW ở tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 10/1 (v/w). Vì vậy chúng tôi lựa chọn tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu thích hợp là 10/1 (v/w). Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol
Thời gian chiết là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới hàm lượng polyphenol. Nếu thời gian chiết kéo dài không những hàm lượng polyphenol giảm mà còn có thể khiến polyphenol bị oxy hóa. Nhưng nếu thời gian chiết ngắn thì không đủ cho dung môi xâm nhập vào trong tế bào để hòa tan polyphenol và chiết rút ra ngoài ít khiến hàm lượng polyphenol thu được thấp. Do vậy cần phải xác định thời gian chiết tối ưu. Kết quả được biểu diễn ở bảng 4.3:
Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol
Công thức Thời gian chiết
(phút) Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW) CT1 25 36,34b CT2 30 37,07a CT3 35 36.87a CT4 40 36.93a
Từ bảng 4.3 cho thấy thời gian tách chiết có ảnh hưởng đến quá trình chiết tách polyphenol từ bã ổi đào. Ta có thể nhận thấy hàm lượng polyphenol tăng khi thời gian chiết từ 25 lên 30 phút là 36,34 mg GAE/g DW lên 37,07 mg GAE/g DW. Nhưng khi tăng thời gian chiết lên 35 và 40 phút thì hàm lượng polyphenol giảm xuống còn 36.78 và 36,93 mg/g DW. Khi chiết ở thời gian là 30 phút thì cho hàm lượng polyphenol là cao nhất, vì vậy chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 30 phút. Kết quả này được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng lớn tới hàm lượng polyphenol thu được sau quá trình chiết. Nhiệt độ làm giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ quá cao sẽ làm giảm hiệu quả của quá trình chiết vì đã làm bay hơi một phần dung môi và gây ảnh hưởng tới trạng thái, cấu trúc của polyphenol. Ngược lại, nhiệt độ thấp thời gian chiết kéo dài, không chiết kiệt được các chất trong bã. Vì vậy cần tìm ra một giá trị nhiệt độ chiết phù hợp, kết quả thu được như sau:
Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol
Công thức Nhiệt độ chiết
(0C) Hàm lượng polyphenol (mg GAE/ g DW) CT1 35 36,74b CT2 40 37,13a CT3 45 36,95ab CT4 50 36,96ab
Ghi chú: Các chữ trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α<0,05
Qua bảng 4.4 ta thấy rằng, hàm lượng polyphenol trong dịch chiết tăng
nhanh ở 35oC từ 36,74 mg GAE/g DW lên đến 37,17 mg GAE/g DW ở 40oC. Tuy
nhiên khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên 45 và 500C thì hàm lượng polyphenol có xu
hướng giảm, giảm tương đối. Hàm lượng polyphenol thu được cao nhất cao nhất ở
nhiệt độ 400C . Vì vậy nhiệt độ chiết thích hợp cho quá trình chiết là 400C, kết quả
4.3. Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu
4.3.1. Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào
Sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box- Behnken với ba biến ba cấp độ. Các số liệu thu được từ dịch chiết polyphenol được xử lý trên phần mềm Design-Expert 7.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, USA) ANOVA được dùng để đánh giá cao thu được. Tiến hành giải bài toán tối ưu theo phương pháp “hàm mong đợi”. Sử dụng phần mềm Design-Expert 7.0 để tiến hành tối ưu hóa nhằm xác định được giá trị của ba yếu tố mà tại đó hàm lương polyphenol là cao nhất. Áp dụng phương pháp phân tích hồi quy các số liệu thực nghiệm, thu được mô hình đa thức bậc hai thể hiện hàm lượng polyphenol :
Y = + 6.20 + 0.029 * A + 8.803 E - 0.003 * B + 0.026 * C + 0.018 * A * B + 0.012
* A * C - 0.11 * A2 - 0.055 * B2 -0.060 * C2
Trong đó Y là hàm lượng polyphenol trong dịch chiết dự báo thu được.
Bảng 4.5. Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Polyphenol từ bã ổi đào
TN Biến thực Hàm lượng polyphenol (mg GAE /g DW) A
(thời gian chiết)
B (nhiệt độ chiết) C (dung môi/ nguyên liệu) 1 25 35 10 36,13 2 35 35 10 36,44 3 25 45 10 35,98 4 35 45 10 37,18 5 25 40 5 35,87 6 35 40 5 36,24 7 25 40 15 36,23 8 35 40 15 37,17 9 30 35 5 36,79 10 30 45 5 36,54 11 30 35 15 37,04 12 30 45 15 37,56 13 30 40 10 38,33 14 30 40 10 38,51 15 30 40 10 38,36 16 30 40 10 38,59 17 30 40 10 38,21
Để đánh giá mô hình chúng tôi sử dụng phân tích ANOVA. Kết quả phân tích ANOVA được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 4.6. Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết polyphenol từ bã ổi đào
Nguồn SS DF MS Chuẩn F Giá trị p
Model 0.099 9 0.011 107.39 < 0.0001 A 6.806E-003 1 6.806E-003 66.70 < 0.0001 B 6.199E-004 1 6.199E-004 6.08 0.0432 C 5.570E-003 1 5.570E-003 54.59 0.0002 AB 1.350E-003 1 1.350E-003 13.23 0.0083 AC 5.470E-004 1 5.470E-004 5.36 0.0538 BC 9.990E-004 1 9.990E-004 9.79 0.0166 A2 0.047 1 0.047 459.10 < 0.0001 B2 0.013 1 0.013 127.00 < 0.0001 C2 0.015 1 0.015 148.78 < 0.0001
Residual 7.142E-004 7 1.020E-004
Lack of Fit 1.231E-004 3 4.105E-005 0.28 0.8395
Sai số (pure error) 5.911E-004 4 1.478E-004
SS tổng Số 0.099 16
SS: Tổng phương sai; DF:Bậc tự do; MS: Trung bình phương sai; chuẩn F: Chuẩn
Fisher; Residual: Phần dư; “Lack of Fit”: Chuẩn đánh giá độ không tương thích
của mô hình với thực nghiệm.
Từ kết quả phân tích ANOVA ta thấy giá trị xác suất của mô hình P-value = 0,0214 < 0,05 do đó mô hình được lựa chọn để giải thích cho kết quả của thí nghiệm, Lack of fit test = (not significant) có ý nghĩa đối với mô hình.
Hình 4.1. Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol
a. Mô hình tương tác giữa nhiệt độ chiết tách và thời gian chiết tách
b. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và thời gian chiết tách c. Mô hình tương tác giữa tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu và nhiệt độ chiết tách
Phương án tốt nhất được dự đoán nhiệt độ chiết tách là 30,73oC, thời gian
chiết tách là 40,52 phút khi đó hàm lượng, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu là 10/1 (v/w), polyphenol đạt 38,4322 mg/g DW. Kết quả kiểm tra bằng thực nghiệm cho kết quả tương ứng.
Hình 4.2. Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol 4.4. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
4.4.1. Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
Khả năng quét gốc tự do DPPH là một trong những phép phân tích để đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong in vitro thường sử dụng nhất trong nghiên cứu, có
đến 90% các nghiên cứu về chất chống oxi hóa sử dụng phép phân tích này (Joon- Kwan và Takayuki, 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết bã ổi đào thể hiện khả năng chống oxi hóa thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH. Trong phạm vi nghiên cứu này, sự tăng khả năng khử gốc tự do DPPH có mối tương quan tuyến tính khá chặt với thể tích dịch chiết sử dụng (R2 = 0,9981). Mối tương quan giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do có dạng: y = 0,4637x + 7.435, trong đó y là khả năng khử gốc tự do DPPH, x là thể tích dịch chiết. Giá trị IC50 của dịch chiết có khả năng khử được 50% gốc tự do DPPH trong điều kiện thí nghiệm được xác định từ mối quan hệ tuyến tính giữa thể tích dịch chiết và khả năng khử gốc tự do DPPH, Giá trị IC50 càng thấp khả năng chống oxy hóa càng cao [10, 11]. Kết quả cho thấy giá trị IC50 của dịch chiết là 91,8 µl thấp hơn 0,91µl so với kết quả trong nghiên cứu của Hồ Minh Hiệp (2013) với giá trị IC50 là 92,71µl. Điều này cho thấy dịch chiết polyphenol trong nghiên cứu này có khả năng chống oxi hoá cao hơn, thể hiện thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH có thể được lý giải là do trong dịch chiết bã quả ổi đào có chứa các chất chống oxi hóa, mà điển hình là các hợp chất polyphenol. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tiềm năng có thể sử dụng bã ổi đào làm nguồn chiết xuất các chất chống oxi hóa và khả năng áp dụng dịch chiết này trong một số lĩnh vực, trong đó có thực phẩm.
4.4.2. Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
4.4.2.1. Kết quả xác định về chỉ tiêu vi sinh vật tổng số
Kết quả khảo sát giới hạn vi sinh vật & nấm men, nấm mốc trong thức ăn chăn nuôi. Tiến hành thí nghiệm xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, kết quả thu được trình bày ở bảng 4.7:
Bảng 4.7. Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006
Tên chỉ tiêu Kết quả Mức tối đa
Tổng số vsv hiếu khí 8,9.104 1.106
Nấm men, nấm mốc 6,7.103 1.105
Qua bảng 4.7 cho thấy chỉ tiêu vi sinh vật tổng số đạt yêu cầu theo quy định ban hành.
4.4.3. Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản có thể bị hư hỏng do bị chua do chất béo bị thủy phân sinh ra các axit béo tự do và glyxerin và bị ôi khét do bị oxy hóa chất béo bởi oxy của không khí, chúng kết hợp với các mạch cacbon không bão hòa của dầu mỡ và cho các peroxyt không bền vững. Các peroxyt này bị phân hủy thành các aldehyt và xeton làm cho thức ăn chăn nuôi bị ôi khét,…
Để đánh giá mức độ thủy phân và oxy hóa của thức ăn chăn nuôi cần xác định chỉ số axit và chỉ số peroxyt… Từ đó đánh giá được chất lượng của thức ăn chăn nuôi trong quá trình bảo quản.
Bảng 4.8. Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi
Giá trị đo Chỉ số axit (mg KOH/g) Chỉ số peroxyt (meq/g)
Bảng 4.9. Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ sung dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản
Ngày bảo quản
Bảo quản điều kiện thường Bảo quản trong dịch chiết
polyphenol Chỉ số axit (mg KOH/g) Chỉ số peroxyt (meq/kg) Chỉ số axit (mg KOH/g) Chỉ số peroxyt (meq/kg) 0 3,08 7,13 3,08 7,13 5 4,12 7,41 4,06 7,28 10 5,34 8,03 5,12 7,35 15 6,89 8,59 6,11 7,48 20 7,16 9,12 6,29 7,78 25 7,97 9,87 6,48 8,32 30 8,21 10,05 6,51 8,85
Theo QCVN 01 - 78: 2011/BNNPTNT (Phụ lục 7) với thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc từ một số nguyên liệu khác nhau có chỉ số peroxyt tối đa cho phép không lớn hơn 40 meq/kg và chỉ số axit tối đa cho phép không vượt quá 60 mg KOH/100g