Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào. Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol.
3.2.2. Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.2.3. Thời gian nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
- Trọng lượng khô của nguyên liệu
- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu
Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp
- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp - Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp - Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp
Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH - Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích
- Quy trình tách chiết polyphenol.
3.4. Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu
3.4.1. Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu
Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991
Nguyên tắc:
Dùng sức nóng để tách ẩm trong vật liệu, đồng thời giữ lại tất cả các chất có trong vật liệu. Do đó nhiệt độ sấy không được quá cao hay quá thấp.
Nhiệt độ quá cao thì ẩm sẽ bốc hơi nhanh nhưng dễ gây hiện tượng làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, nhất là các chất có tính bay hơi thoát đi sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Nhiệt độ quá thấp thì hơi thoát ra chậm, làm kéo dài thời gian và các chất bị biến đổi. Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991
- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi
đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định
- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:
+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g + Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)
+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm
Cách tiến hành:
- Lấy chén cân có thể đựng được 10g mẫu, rửa sạch sau đó đem sấy ở 1050C
cho đến khi trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm 20-25 phút và sau đó cân với trọng lượng chính xác
- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu. Cân tất cả ở cân phân tích một cách
chính xác.
- Cho tất cả vào tủ sấy ở 1050C, sấy trong vòng từ 6h cho đến khi trọng
lượng không đổi.
- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân
phân tích một cách chính xác.
- Cho lại vào tủ sấy 1050C trong 1giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm
(20-25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác tới khi trọng lượng không đổi.
Tính kết quả:
Độ ẩm (W) được tính theo phần trăm khối lượng xác định bằng công thức:
W = 𝑚−𝑚₁
𝑚 × 100
- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g).
- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g).
3.4.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết bã quả ổi đào được xác định bằng phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ như sau: dịch chiết từ bã quả ổi đào được pha loãng đến một tỷ lệ nhất định, sau đó 0,1 ml dịch chiết đã pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc
thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế. Gallic acid được dùng làm chất chuẩn. Hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (Gallic Acid Equivalent-GAE) trên 1g chất khô (Dry Weight-DW) hay mg GAE/g DW.
Tính kết quả:
TPC = X * V * k / v * m * (1 - w) Trong đó:
- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW) - X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml) - V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml) - K là hệ số pha loãng
- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml) - m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g) - w là độ ẩm của mẫu (%)
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu
Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, thối hỏng. Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy bã. Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện:
Dung môi chiết là nước, nhiệt độ và thời gian chiết lần lượt là 40oC và 30 phút, tỉ lệ
nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v). Dịch chiết thu được sau khi tách chiết được mang đi xác định hàm lượng polyphenol.
3.5.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.5.2.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng. Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước.
Tách chiết polyphenlol từ bã ổi đào:
Ổi đào được thu hái, sau đó rửa sạch để ráo nước rồi tiến hành xay nhỏ để lấy phần bã, tách chiết polyphenol bằng các loại dung môi: methanol, ethanol, nước. Cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và để vào thiết bị rung lắc để tiến hành trích ly. Tiến hành tách chiết bằng phương pháp trích ly trong vòng
30 phút, cường độ 200 vòng/phút và nhiệt độ là 40oC. Sau khi kết thúc quá trình
chiết tiến hành ly tâm ở 4oC, 5000rpm/phút, tiếp tục lọc lại dịch chiết để thu dịch
chiết trong, dịch chiết có màu hồng phớt nhẹ.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết
Để nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết, sử dụng 3 loại dung môi
khác nhau bao gồm: Nước (H20), methanol (CH3OH) 60o và ethanol (C2H5OH) 60o.
Để đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi chiết tới khả năng trích ly bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:
Cân 4g (Bã ổi đào)
Trích ly ở các loại dung môi
H20 CH3OH C2H5OH
Dịch chiết
Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Nhiệt độ tách chiết: 400C
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu nồng độ dung môi phù hợp:
Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol Được bố trí gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần
Cân 4g (bã ổi đào)
Trích ly ở các nồng độ dung môi
20% 40% 60% 80%
Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:
Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1 Thời gian chiết: 30 phút
Nhiệt độ tách chiết: 400C
Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn nồng độ dung môi chiết tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 2 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu phù hợp:
Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:
Cân 4g (bã ổi đào)
Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
1/5 1/10 1/15 1/20
Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2
Nhiệt độ tách chiết 400C
Thời gian tách chiết 30 phút
Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tách chiết tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết
Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:
Cân 4g (bã ổi đào)
Trích ly ở các khoảng thời gian
25phút 30phút 35 phút 40 phút
Dịch chiết Phân tích
Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3.
Nhiệt độ tách chiết 400C
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được thời gian chiết tách tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 4 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:
Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nhiệt độ
350C 400C 450C 500C
Dịch chiết Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:
Loại dung môi, nồng độ dung môi, tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu, thời gian tách chiết tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1, 2, 3, 4.
Kết thúc quá trình chiết, xác định hàm lượng polyphenol.
Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được nhiệt độ tốt nhất. Kết quả của thí nghiệm 5 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3
Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa điều kiện tách chiết bã ổi đào
Sau khi tiến hành khảo sát các đơn nhân tố, chúng tôi lựa chọn 03 yếu tố ký hiệu là A, B, C là các yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng polyphenol trong
bã ổi đào để đánh giá khả năng ảnh hưởng của chúng, tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm của Box-Benhken với ba yếu tố, ba cấp độ.
Bảng 3.3. Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
A Thời gian tách chiết phút 25 35
B Nhiệt độ tách chiết oC 35 45
C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1/g 5/1 15/1
Lập ma trận thực nghiệm Box - Behnken: Gồm 17 thí nghiệm kết hợp các yếu tố với 3 mức +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và mức 0 (mức trung bình), trong đó 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm (các yếu tố đều ở mức 0) (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol của dịch chiết bã ổi đào
Công thức
Biến mã hóa
A. Thời gian B. Nhiệt độ C. Tỷ lệ dung môi/
nguyên liệu 1 25 35 10 2 35 35 10 3 25 45 10 4 35 45 10 5 25 40 5 6 35 40 5 7 25 40 15 8 35 40 15 9 30 35 5 10 30 45 5 11 30 35 15 12 30 45 15 13 30 40 10 14 30 40 10 15 30 40 10 16 30 40 10 17 30 40 10
Dựa vào kết quả thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có kết quả hàm lượng polyphenol là cao nhất.
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
3.5.3.1. Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo phương pháp của Fu và CS (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Khoảng 30 µl đến 120 µl dịch chiết trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM, lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thụ quang học được đo ở bước sóng 517 nm trên máy đo quang phổ. Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau:
DPPH (%) = 100 * (ACT – ASP) / ACT. Trong đó:
- ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết
- ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết.
Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại ba lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình.
3.5.3.2. Ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo
Thức ăn chăn nuôi rất dễ bị hư hỏng trong quá trình bảo quản. Tiến hành kiểm tra mức độ hư hỏng của thức ăn chăn nuôi bằng cách thông qua việc xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số, chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi giàu chất béo.
Phương pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật tổng số
Giới hạn vi khuẩn, nấm mốc (3113/1999/QĐ-BYT ngày 11/10/1999 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
Vi sinh vật là cơ thể sống có kích thước rất nhỏ quan sát được bằng kính hiển vi, bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh và virus.
Vi sinh vật tổng số là tất cả vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển được trên
môi trường dinh dưỡng chung, ở 30 10C sau một thời gian nuôi cấy nhất định
trong 24-72 h.
Xác định tổng số vi sinh vật tổng số để đánh giá mức độ nhiễm tạp của nguyên liệu và sản phẩm, từ đó đánh giá tình trạng vệ sinh, điều kiện bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của sản phẩm…
Phương pháp này cho phép phát hiện những tế bào vi sinh vật còn sống có trong mẫu (ở cả dạng rắn và lỏng). Mặc dù đây không phải là một phương pháp đếm vi sinh vật một cách nhanh chóng nhưng nó thường được dùng như là phương pháp chuẩn để xác định số lượng vi sinh vật thực phẩm.
- Nguyên tắc:
Cấy chính xác một thể tích mẫu (hoặc dịnh pha loãng) vào trong hoặc lên trên bề mặt môi trường thạch. Từ mỗi độ pha loãng cần cấy lặp lại ít nhất là 2 hộp. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha loãng liên tiếp để làm sao trên mỗi hộp có từ 30- 300 khuẩn lạc/hộp. Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp cho các vi sinh vật phát triển, sau đó đếm số lượng các khuẩn lạc mọc lên. Có thể coi mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển từ một tế bào [7].
- Thiết bị:
+ Hộp Petri
+ Que trang thủy tinh hoặc kim loại + Ống nghiệm dùng để pha loãng mẫu
- Hóa chất:
+ Thức ăn chăn nuôi
+ Nước cất vô trùng, đã qua lọc. + Môi trường thạch thích hợp.
Thực hiện cấy trên môi trường thạch TGA: - Pepton: 5g
- Glucose: 5g - Thạch: 15 g
- Cao nấm men: 2,5g - Nước cất: 1000 ml
- Cách tiến hành [7]
Hoà tan các chất trong nước, đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan hoàn toàn. Đóng vào các bình dung tích 250ml, mỗi bình 150ml. Hấp tiệt trùng trong nồi hấp
121oC trong thời gian 15 - 20 phút. Môi trường nếu không dùng ngay, cần được bảo
quản nơi khô ráo, trong bóng tối, ở nhiệt độ từ 0 đến 5oC không quá 30 ngày.
Chuẩn bị dịch pha loãng.
Pha loãng mẫu đến nồng độ cần thiết.
- Cấy trong môi trường thạch
+ Đưa một cách vô trùng 1ml mẫu đã pha loãng đến nồng độ cần thiết vào đĩa Petri vô trùng.
+ Rót khoảng 15–18 ml môi trường thạch đã hóa lỏng trên nồi cách thủy (nhiệt độ khoảng 45˚C) vào mỗi đĩa đã có mẫu. Mỗi mẫu cần làm ít nhất 2 độ pha