3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.6. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN
1.6.1. Chẩn đoán dịch tễ học
Bệnh cúm gia cầm có tính chất lây lan nhanh và mạnh, loài mắc bệnh thường là gia cầm và các loài chim hoang dã. Gia cầm ở mọi lứa tuổi đều mắc, nhưng thường từ 4-66 tuần tuổi, đặc biệt là gia cầm trong thời kỳ đẻ. Bệnh thường xảy ra vào lúc thời tiết giao mùa khi điều kiện khí hậu bất lợi (thường từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau). Bệnh xảy ra nhanh chóng, có thể từ vài giờ đến vài ngày, tỷ lệ chết rất cao, có khi 100%.
1.6.2. Chẩn đoán lâm sàng
Bệnh cúm gia cầm có triệu chứng lâm sàng rất đa dạng và dễ nhầm lẫn với một số bệnh khác như CRD, Newcastle, tụ huyết trùng gia cầm. Nếu chỉ dựa vào triệu chứng thì khó có thể phát hiện ra bệnh trừ trường hợp dịch bệnh đã xảy ra, do vậy để chính xác cần phải tiến hành phân lập virus.
1.6.3. Chẩn đoán virus học
Bệnh phẩm để phân lập virus bao gồm:
- Dịch hầu họng, khí quản, ổ nhớp: dùng tăm bông ngoáy nhẹ trên bề mặt niêm mạc hầu họng, lỗ huyệt rồi cho vào ống nghiệm tiệt trùng có 1-2 ml bảo quản có kháng sinh liều cao.
- Phân hoặc các chất chứa đường ruột.
- Các bộ phận nội tạng: phổi, gan, lách được lấy mẫu đặt trong ống nhựa hoặc túi nhựa đã tiệt trùng.
Mẫu sau khi lấy xong được bảo quản ở nhiệt độ 40C và cần tiến hành phân lập trước 48 giờ, trường hợp bảo quản mẫu phải được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu -700C.
Bệnh phẩm sau khi được xử lý tiêm vào phôi gà 9-11 ngày tuổi đem vào tủ ấm 370C. Sau 72 giờ thu hoạch phôi chết hoặc phôi sống đã gây nhiễm, mổ trứng thu hoạch dịch trong xoang niệu rồi tiến hành phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA) để xác định sự hiện của virus.
Phương pháp phổ biến và cho kết quả nhanh nhất hiện nay là dùng kỹ thuật RT- PCA (Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) cho phép xác định virus với số lượng rất nhỏ và khẳng định các subtyp H5, H7 căn cứ vào các primer đặc hiệu.
1.6.4. Chẩn đoán huyết thanh học
Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) hay phản ứng miễn dịch gắn men ELISA phát hiện kháng thể kháng virus
trong máu của gia cầm. Phương pháp này cho kết quả chính xác cao, phát hiện nhanh và sớm bệnh cúm gia cầm.
1.7. HIỂU BIẾT VỀ KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR 1.7.1. Phản ứng Realtime RT-PCR 1.7.1. Phản ứng Realtime RT-PCR
Phản ứng Real Time RT - PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Real Time RT - PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy Bio - Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (cycle of threshold). Đây là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng RT - PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA→DNA gọi là Reverse Transcription nên phương pháp này được gọi là Real Time RT - PCR.
1.7.2. Cơ chế hoạt động của Real time PCR sử dụng Taqman probe làm chất phát huỳnh quang huỳnh quang
Trong kỹ thuật này, real – time PCR mix ngoài các thành phần cơ bản của PCR mix, còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) Taqman probe, là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter. (2) En- zyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả ăng thuỷ giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong các chu kỳ nhiệt được trình bày minh hoạ ở hình 1.8.
.
Hình 1.8. Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe
Có thể tóm tắt như sau: (1) Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn nguyên vẹn do vậy mà huỳnh quang phát ra được từ đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của probe hấp phụ, ống thử nghiệm sẽ không phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (2) Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản phẩm này ở giai đoạn nhiệt độ bắt cặp. (3)Taqman probe sẽ bị enzyme Taqman polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà re- porter của Taqman probe sẽ bị cắt rời xa quencher và phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích. (4) Càng nhiều sản phẩm khuếch đại xuất hiện thì số lượng reporter tự do sẽ càng nhiều, đến một lúc nào đó cường độ huỳnh quang phát ra từ reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được nguồn sáng kích thích.
1.8. HIỂU BIẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN.
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là: A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử DNA.
Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P
1.8.1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là:
- Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);
- Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung .
- Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA .
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu 32
P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.
Hình 1.9. Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*AdC CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA thêm d*NTP, DNA polymer- thêm d*NTP, DNA polymer- thêm d*NTP, DNA polymer- thêm d*NTP, DNA polymer- CCTTACG GGAATGC CATACGTGG CCTTAC G
điện di trên gel
Chiều điện di CATACGTGG
1.8.2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA
Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và hiện nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ
Hình 1.10. Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ. Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nu- cleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA pol- ymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc .
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA
1.8.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di.
Màu 1 Màu 2 Màu 3 Màu 4 Mắt cảm quang `
Hình 1.11: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản gel polyacrylamide
Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm vàmkhi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây. Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít.
Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme
cắt giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán, hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự DNA trong thí nghiệm hay một trình tự DNA nạp vào máy, hay có thể trình tự acid amin của protein, với các trình tự khác đã có trong ngân hàng dữ liệu để phát hiện được sự tương đồng với trình tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở để xác định gen và chức năng gen...
1.9. ỨNG DỤNG HỆ THỐNG THÔNG TIN ĐỊA LÝ TRONG QUẢN LÝ DỊCH BỆNH CÚM GIA CẦM BỆNH CÚM GIA CẦM
Thuật ngữ GIS (Geographic Information System) được sử dụng thường xuyên trong nhiều chuyên ngành, lĩnh vực khác nhau như địa lý, tin học, các hệ thống tích hợp thông tin ứng dụng trong quản lý tài nguyên, môi trường, khoa học xử lý dữ liệu không gian…
Do đó cũng có nhiều định nghĩa được đưa ra tùy đối tượng sử dụng và cách tiếp cận. Nhưng có thể hiểu một cách chung nhất: “GIS là hệ thống làm việc với loại thông tin đặc biệt: thông tin Địa lý (gồm thông tin về vị trí Địa lý và thuộc tính của đối tượng). Mỗi hệ GIS gồm các thành phần: phần cứng, phần mềm, dữ liệu, con người và quy trình; và các chức năng: nhập dữ liệu, quản lý dữ liệu, phân tích dữ liệu, hiển thị/xuất dữ liệu.”
Ngày nay, dịch bệnh ngày càng diễn biến phức tạp và nguy hiểm. Việc nghiên cứu, giám sát và kiểm soát dịch bệnh là rất quan trọng và đòi hỏi kiến thức chuyên môn của các nhà dịch tễ học. Ngoài ra, công tác nghiên cứu dịch tễ học nói chung và giám sát dịch bệnh nguy hiểm nói riêng đòi hỏi có sự hỗ trợ của phần mềm máy tính như phần mềm thống kê, phần mềm GIS và phần mềm mô hình hóa. Sử dụng các công